Moderna biologija zadivljuje jedinstvenošću i razmjerom svojih otkrića. Danas ova znanost proučava većinu procesa koji su skriveni od naših očiju. Ovo je izvanredno za molekularnu biologiju - jedno od obećavajućih područja koje pomaže razotkriti najsloženije misterije žive tvari.
Što je obrnuta transkripcija
Reverzna transkripcija (skraćeno RT) je specifičan proces karakterističan za većinu RNA virusa. Njegova glavna značajka je sinteza dvolančane DNK molekule na temelju glasničke RNA.
OT nije karakterističan za bakterije ili eukariotske organizme. Glavni enzim, reversetaza, igra ključnu ulogu u sintezi dvolančane DNK.
Povijest otkrića
Ideja da bi molekula ribonukleinske kiseline mogla postati predložak za sintezu DNK smatrala se apsurdnom sve do 1970-ih. Tada su B altimore i Temin, radeći odvojeno jedan od drugog, gotovo istovremeno otkrili novi enzim. Nazvali su je RNA-ovisna-DNA polimeraza ili reverzna transkriptaza.
Otkriće ovog enzima je bezuvjetno potvrdilo postojanje organizamasposoban za obrnutu transkripciju. Oba su znanstvenika dobila Nobelovu nagradu 1975. godine. Nakon nekog vremena, Engelhardt je predložio alternativni naziv za obrnutu transkriptazu - revertaza.
Zašto OT proturječi središnjoj dogmi molekularne biologije
Središnja dogma je koncept sekvencijalne sinteze proteina u bilo kojoj živoj stanici. Takva shema je izgrađena od tri komponente: DNK, RNA i proteina.
Prema središnjoj dogmi, RNA se može sintetizirati isključivo na DNK predlošku, a tek tada RNA sudjeluje u izgradnji primarne strukture proteina.
Ova dogma je službeno prihvaćena u znanstvenoj zajednici prije otkrića obrnute transkripcije. Nije iznenađujuće da su znanstvenici dugo odbacivali ideju o obrnutoj sintezi DNK iz RNA. Tek 1970. godine, zajedno s otkrićem reversetaze, okončan je ovaj problem, što se odrazilo na koncept sinteze proteina.
Povratak ptičjih retrovirusa
Proces reverzne transkripcije nije potpun bez sudjelovanja RNA-ovisne DNA polimeraze. Revertaza ptičjeg retrovirusa proučavana je u najvećoj mjeri do sada.
Samo oko 40 molekula ovog proteina može se naći u jednom virionu ove obitelji virusa. Protein se sastoji od dvije podjedinice koje su u jednakom broju i obavljaju tri važne funkcije reverzibilne:
1) Sinteza molekule DNK i na jednolančanoj/dvolančanoj RNA šabloni i na bazi deoksiribonukleinskih kiselina.
2) Aktivacija RNase H, čija je glavna uloga dacijepanje RNA molekule u kompleksu RNA-DNA.
3) Uništavanje dijelova DNK molekula za umetanje u eukariotski genom.
Mehanizam OT
Koraci obrnute transkripcije mogu se razlikovati ovisno o obitelji virusa, tj. o vrsti njihovih nukleinskih kiselina.
Razmotrimo prvo one viruse koji koriste reversetazu. Ovdje je OT proces podijeljen u 3 koraka:
1) Sinteza “-” RNA lanca na predlošku “+” RNA lanca.
2) Uništavanje "+" lanca RNA u kompleksu RNA-DNA korištenjem enzima RNase H.
3) Sinteza dvolančane molekule DNA na predlošku "-" RNA lanca.
Ova metoda reprodukcije viriona tipična je za neke onkogene viruse i virus ljudske imunodeficijencije (HIV).
Vrijedi napomenuti da je za sintezu bilo koje nukleinske kiseline na RNA predlošku potrebno sjeme ili primer. Primer je kratki slijed nukleotida koji je komplementaran 3' kraju molekule RNA (template) i igra važnu ulogu u pokretanju sinteze.
Kada su gotove dvolančane DNA molekule virusnog podrijetla integrirane u eukariotski genom, pokreće se uobičajeni mehanizam sinteze virionskog proteina. Kao rezultat toga, stanica "zarobljena" virusom postaje tvornica za proizvodnju viriona, gdje se stvaraju potrebne molekule proteina i RNA u velikim količinama.
Drugi način reverzne transkripcije temelji se na djelovanju RNA sintetaze. Ovaj protein je aktivan u paramiksovirusima, rabdovirusima, pikornovirusima. U ovom slučaju ne postoji treći stupanj OT – formiranjedvolančana DNK, a umjesto toga, "+" RNA lanac se sintetizira na šabloni virusnog "-" RNA lanca i obrnuto.
Ponavljanje takvih ciklusa dovodi i do replikacije genoma virusa i do stvaranja mRNA sposobne za sintezu proteina u uvjetima inficirane eukariotske stanice.
Biološko značenje obrnute transkripcije
Proces OT je od iznimne važnosti u životnom ciklusu mnogih virusa (prvenstveno retrovirusa kao što je HIV). RNA viriona koji je napao eukariotsku stanicu postaje predložak za sintezu prvog lanca DNK, na kojem nije teško dovršiti drugi lanac.
Dobljena dvolančana DNK virusa integrirana je u eukariotski genom, što dovodi do aktivacije procesa sinteze proteina viriona i pojave velikog broja njegovih kopija unutar zaražene stanice. Ovo je glavna misija Revertase i OT općenito za virus.
Reverzna transkripcija se također može dogoditi kod eukariota u kontekstu retrotranspozona - mobilnih genetskih elemenata koji se mogu neovisno transportirati iz jednog dijela genoma u drugi. Takvi su elementi, prema znanstvenicima, uzrokovali evoluciju živih organizama.
Retrotranspozon je dio eukariotske DNK koji kodira nekoliko proteina. Jedna od njih, reversetaza, izravno je uključena u delokalizaciju takvog retrotransporozona.
Upotreba OT-a u znanosti
Od trenutka kada je reversetaza izolirana u svom čistom obliku, proces reverzne transkripcije usvojili su biolozi. Proučavanje OT mehanizma još uvijek pomaže u čitanju sekvenci najvažnijih ljudskih proteina.
Činjenica je da genom eukariota, uključujući nas, sadrži neinformativna područja koja se nazivaju introni. Kada se iz takve DNK očita nukleotidni slijed i formira se jednolančana RNA, potonja gubi introne i kodira isključivo protein. Ako se DNA sintetizira korištenjem reverznetaze na RNA predlošku, onda ju je lako sekvencirati i saznati redoslijed nukleotida.
Nukleinska kiselina koja je nastala reverznom transkriptazom naziva se cDNA. Često se koristi u lančanoj reakciji polimeraze (PCR) za umjetno povećanje broja kopija rezultirajuće kopije cDNA. Ova metoda se koristi ne samo u znanosti, već iu medicini: laboratorijski asistenti određuju sličnost takve DNK s genomima raznih bakterija ili virusa iz zajedničke biblioteke. Sinteza vektora i njihovo uvođenje u bakterije jedno je od obećavajućih područja biologije. Ako se RT koristi za formiranje DNK ljudi i drugih organizama bez introna, takve se molekule lako mogu uvesti u bakterijski genom. Tako potonje postaju tvornice za proizvodnju tvari potrebnih za osobu (na primjer, enzima).
