Molekularno biološke metode istraživanja igraju veliku ulogu u modernoj medicini, forenzici i biologiji. Zahvaljujući napretku u proučavanju DNK i RNA, osoba može proučavati genom organizma, odrediti uzročnika bolesti, prepoznati željenu nukleinsku kiselinu u mješavini kiselina, itd.
Molekularno biološke metode istraživanja. Što je to?
Danas 70-ih i 80-ih godina, znanstvenici su prvi put uspjeli dešifrirati ljudski genom. Ovaj događaj dao je poticaj razvoju genetskog inženjeringa i molekularne biologije. Proučavanje svojstava DNA i RNA dovelo je do činjenice da je sada moguće koristiti ove nukleinske kiseline za dijagnosticiranje bolesti, proučavanje gena.
Dobivanje DNK i RNA
Molekularno-biološke dijagnostičke metode zahtijevaju prisutnost polaznog materijala: češće su to nukleinske kiseline. Postoji nekoliko načina da se te tvari izoliraju iz stanica živih organizama. Svaki od njih ima svoje prednosti i nedostatke, i to je neophodnouzeti u obzir pri odabiru metode za izolaciju čistih nukleinskih kiselina.
1. Dobivanje DNK prema Marmuru. Metoda se sastoji u tretiranju mješavine tvari alkoholom, uslijed čega se taloži čista DNK. Nedostatak ove metode je korištenje agresivnih tvari: fenola i kloroforma.
2. Izolacija DNK prema Boomu. Glavna tvar koja se ovdje koristi je gvanidin tiocijanat (GuSCN). Pridonosi taloženju deoksiribonukleinske kiseline na specijaliziranim supstratima, s kojih se naknadno može prikupiti posebnim puferom. Međutim, GuSCN je inhibitor PTC-a, pa čak i njegov mali dio koji uđe u precipitiranu DNK može utjecati na tijek lančane reakcije polimeraze, koja igra važnu ulogu u radu s nukleinskim kiselinama.
3. Sedimentacija nečistoća. Metoda se razlikuje od prethodnih po tome što se ne talože molekule deoksiribonukleinske kiseline, već nečistoće. Za to se koriste ionski izmjenjivači. Nedostatak je što se sve tvari ne mogu taložiti.
4. Masovna projekcija. Ova metoda se koristi u slučajevima kada nisu potrebni točni podaci o sastavu molekule DNA, ali je potrebno dobiti neke statističke podatke. To se objašnjava činjenicom da se struktura nukleinske kiseline može oštetiti kada se tretira deterdžentima, posebno alkalijama.
Klasifikacija istraživačkih metoda
Sve metode molekularno-biološkog istraživanja podijeljene su u tri velike skupine:
1. Amplifikacija (koristeći mnogo enzima). Ovdjeodnosi se na PCR - lančanu reakciju polimeraze, koja igra veliku ulogu u mnogim dijagnostičkim metodama.
2. Nepojačavajuće. Ova skupina metoda izravno je povezana s djelovanjem smjesa nukleinskih kiselina. Primjeri su 3 mrlje, in situ hibridizacija, itd.
3. Metode temeljene na prepoznavanju signala iz molekule sonde koja se veže na DNA ili RNA specifične sonde. Primjer je Hybride Capture System (hc2).
Enzimi koji se mogu koristiti u metodama istraživanja molekularne biologije
Mnoge molekularne dijagnostičke metode uključuju korištenje širokog spektra enzima. U nastavku su najčešće korišteni:
1. Restrikcioni enzim - "reže" molekulu DNK na potrebne dijelove.
2. DNA polimeraza - sintetizira dvolančanu molekulu deoksiribonukleinske kiseline.
3. Reverzna transkriptaza (revertaza) - koristi se za sintezu DNK na RNA predlošku.
4. DNA ligaza - odgovorna za stvaranje fosfodiesterskih veza između nukleotida.
5. Egzonukleaza - uklanja nukleotide iz terminalnih dijelova molekule deoksiribonukleinske kiseline.
PCR je glavna metoda amplifikacije DNK
Polimerazna lančana reakcija (PCR) aktivno se koristi u modernoj molekularnoj biologiji. Ovo je metoda u kojoj se iz jedne molekule DNK može dobiti ogroman broj kopija (molekule se pojačavaju).
Glavne funkcije PCR-a:
- dijagnostikabolesti;
- kloniranje DNK segmenata, gena.
Za izvođenje lančane reakcije polimeraze potrebni su sljedeći elementi: početna molekula DNA, termostabilna DNA polimeraza (Taq ili Pfu), deoksiribonukleotidni fosfati (izvori dušičnih baza), početnici (2 primera po 1 molekuli DNA) i sam sustav tampon u kojem su sve reakcije moguće.
PCR se sastoji od tri koraka: denaturacija, žarenje temeljnog premaza i elongacija.
1. Denaturacija. Na temperaturi od 94-95 stupnjeva Celzija prekidaju se vodikove veze između dva lanca DNK, a kao rezultat dobivamo dvije jednolančane molekule.
2. Žarenje temeljnog premaza. Na temperaturi od 50-60 stupnjeva Celzija, početnici se pričvršćuju na krajeve jednolančanih molekula nukleinske kiseline prema vrsti komplementarnosti.
3. Produljenje. Na temperaturi od 72 stupnja dolazi do sinteze kćeri dvolančanih molekula deoksiribonukleinske kiseline.
DNK sekvenciranje
Molekularno biološke metode istraživanja često zahtijevaju poznavanje nukleotidnog slijeda u molekuli deoksiribonukleinske kiseline. Sekvenciranje se provodi kako bi se odredio genetski kod. Molekularna dijagnostika budućnosti temeljit će se na znanju stečenom ljudskim sekvenciranjem.
Razlikuju se sljedeće vrste sekvenciranja:
- Maxam-Gilbert sekvenciranje;
- Sanger sekvenciranje;
- pirosekvencija;
- nanoporeslijed.
