Koncept imobiliziranih enzima prvi se put pojavio u drugoj polovici 20. stoljeća. U međuvremenu, davne 1916. godine otkriveno je da je saharoza sorbirana na ugljiku zadržala svoju katalitičku aktivnost. Godine 1953. D. Schleit i N. Grubhofer izveli su prvo vezanje pepsina, amilaze, karboksipeptidaze i RNKaze s netopivim nosačem. Koncept imobiliziranih enzima legaliziran je 1971. To se dogodilo na prvoj konferenciji o inženjerskoj enzimologiji. Danas se pojam imobiliziranih enzima razmatra u širem smislu nego što je bio na kraju 20. stoljeća. Pogledajmo pobliže ovu kategoriju.
Opće informacije
Imobilizirani enzimi su spojevi koji su umjetno vezani na netopivi nosač. Međutim, oni zadržavaju svoja katalitička svojstva. Trenutno se ovaj proces razmatra u dva aspekta - u okviru djelomičnog i potpunog ograničenja slobode kretanja proteinskih molekula.
Dostojanstvo
Znanstvenici su ustanovili određene prednosti imobiliziranih enzima. Djelujući kao heterogeni katalizatori, mogu se lako odvojiti od reakcijskog medija. U sklopu istraživanja ustanovljeno je da se korištenje imobiliziranih enzima može ponoviti. Tijekom procesa vezanja, veze mijenjaju svoja svojstva. Oni stječu specifičnost i stabilnost supstrata. Istodobno, njihova aktivnost počinje ovisiti o uvjetima okoliša. Imobilizirani enzimi su izdržljivi i imaju visok stupanj stabilnosti. Veći je od, na primjer, slobodnih enzima za tisuće, desetke tisuća puta. Sve to osigurava visoku učinkovitost, konkurentnost i ekonomičnost tehnologija u kojima su prisutni imobilizirani enzimi.
Mediji
J. Poratu je identificirao ključna svojstva idealnih materijala koji će se koristiti u imobilizaciji. Nositelji moraju imati:
- Netopivost.
- Visoka biološka i kemijska otpornost.
- Mogućnost brzog aktiviranja. Nosači bi trebali lako postati reaktivni.
- Značajna hidrofilnost.
- Potrebna propusnost. Njegov indikator trebao bi biti jednako prihvatljiv i za enzime i za koenzime, produkte reakcije i supstrate.
Trenutno ne postoji materijal koji u potpunosti zadovoljava ove zahtjeve. Ipak, u praksi se koriste nosači koji su prikladni za imobilizaciju.određena kategorija enzima pod određenim uvjetima.
Klasifikacija
Ovisno o svojoj prirodi, materijali u vezi s kojima se spojevi pretvaraju u imobilizirane enzime dijele se na anorganske i organske. Vezivanje mnogih spojeva provodi se s polimernim nosačima. Ovi organski materijali podijeljeni su u 2 klase: sintetički i prirodni. U svakom od njih, pak, razlikuju se skupine ovisno o strukturi. Anorganski nosači uglavnom su zastupljeni materijalima od stakla, keramike, gline, silikagela i grafitne crne. Pri radu s materijalima popularne su metode suhe kemije. Imobilizirani enzimi se dobivaju prevlačenjem nosača filmom od titanovih, aluminijskih, cirkonijevih, hafnijevih oksida ili preradom s organskim polimerima. Važna prednost materijala je lakoća regeneracije.
Nosači proteina
Najpopularniji su lipidni, polisaharidni i proteinski materijali. Među potonjima, vrijedi istaknuti strukturne polimere. To prvenstveno uključuje kolagen, fibrin, keratin i želatinu. Takvi proteini su široko rasprostranjeni u prirodnom okruženju. Oni su pristupačni i ekonomični. Osim toga, imaju velik broj funkcionalnih skupina za vezanje. Proteini su biorazgradivi. To omogućuje proširenje upotrebe imobiliziranih enzima u medicini. U međuvremenu, proteini također imaju negativna svojstva. Nedostaci korištenja imobiliziranih enzima na proteinskim nosačima su visoka imunogenost potonjih, kao isposobnost uvođenja samo određenih skupina njih u reakcije.
Polisaharidi, aminosaharidi
Od ovih materijala najčešće se koriste hitin, dekstran, celuloza, agaroza i njihovi derivati. Kako bi polisaharidi bili otporniji na reakcije, njihovi linearni lanci su umreženi epiklorohidrinom. Različite ionogene skupine slobodno se uvode u mrežne strukture. Hitin se nakuplja u velikim količinama kao otpad tijekom industrijske prerade škampa i rakova. Ova je tvar otporna na kemikalije i ima dobro definiranu poroznu strukturu.
Sintetički polimeri
Ova grupa materijala je vrlo raznolika i dostupna. Uključuje polimere na bazi akrilne kiseline, stirena, polivinil alkohola, poliuretana i poliamidnih polimera. Većina ih je mehanički jaka. U procesu transformacije daju mogućnost variranja veličine pora u prilično širokom rasponu, uvodeći različite funkcionalne skupine.
Metode vezanja
Trenutno postoje dvije bitno različite opcije za imobilizaciju. Prvi je dobivanje spojeva bez kovalentnih veza s nosačem. Ova metoda je fizička. Druga mogućnost uključuje pojavu kovalentne veze s materijalom. Ovo je kemijska metoda.
Adsorpcija
Uz pomoć njega dobivaju se imobilizirani enzimi držanjem lijeka na površini nosača zbogdisperzijske, hidrofobne, elektrostatičke interakcije i vodikove veze. Adsorpcija je bila prvi način ograničavanja mobilnosti elemenata. Međutim, ni sada ova opcija nije izgubila na važnosti. Štoviše, adsorpcija se smatra najčešćom metodom imobilizacije u industriji.
Obilježja metode
Znanstvene publikacije opisuju više od 70 enzima dobivenih metodom adsorpcije. Nosači su uglavnom bili porozno staklo, razne gline, polisaharidi, aluminijevi oksidi, sintetski polimeri, titan i drugi metali. Potonji se najčešće koriste. Učinkovitost adsorpcije lijeka na nosaču određena je poroznošću materijala i specifičnom površinom.
Mehanizam djelovanja
Adsorpcija enzima na netopivim materijalima je jednostavna. Postiže se kontaktom vodene otopine lijeka s nosačem. Može proći na statički ili dinamički način. Otopina enzima se pomiješa sa svježim sedimentom, na primjer, titanovim hidroksidom. Spoj se zatim suši pod blagim uvjetima. Aktivnost enzima tijekom takve imobilizacije zadržava se gotovo 100%. U isto vrijeme, specifična koncentracija doseže 64 mg po gramu nosača.
Negativni trenuci
Nedostaci adsorpcije uključuju nisku čvrstoću pri vezivanju enzima i nosača. U procesu promjene uvjeta reakcije može se primijetiti gubitak elemenata, kontaminacija proizvoda i desorpcija proteina. Za poboljšanje snagevezni nosači su unaprijed modificirani. Posebno se materijali obrađuju metalnim ionima, polimerima, hidrofobnim spojevima i drugim polifunkcionalnim sredstvima. U nekim slučajevima, sam lijek je izmijenjen. Ali vrlo često to dovodi do smanjenja njegove aktivnosti.
Uključivanje u gel
Ova je opcija prilično česta zbog svoje jedinstvenosti i jednostavnosti. Ova metoda je prikladna ne samo za pojedinačne elemente, već i za komplekse s više enzima. Ugradnja u gel može se izvršiti na dva načina. U prvom slučaju, lijek se kombinira s vodenom otopinom monomera, nakon čega se provodi polimerizacija. Kao rezultat, pojavljuje se prostorna struktura gela koja sadrži molekule enzima u stanicama. U drugom slučaju, lijek se uvodi u otopinu gotovog polimera. Zatim se stavlja u gel stanje.
Upad u prozirne strukture
Suština ove metode imobilizacije je odvajanje vodene otopine enzima od supstrata. Za to se koristi polupropusna membrana. Omogućuje prolazak elemenata niske molekularne težine kofaktora i supstrata i zadržava velike molekule enzima.
Mikrokapsulacija
Postoji nekoliko opcija za ugradnju u prozirne strukture. Od njih, mikrokapsuliranje i ugradnja proteina u liposome su od najvećeg interesa. Prvu opciju predložio je 1964. T. Chang. Sastoji se od činjenice da se otopina enzima unosi u zatvorenu kapsulu čiji su zidovi izrađeni od polupropusnihpolimer. Pojava membrane na površini uzrokovana je reakcijom međufazne polikondenzacije spojeva. Jedan od njih je otopljen u organskoj, a drugi - u vodenoj fazi. Primjer je formiranje mikrokapsule dobivene polikondenzacijom halida sebacinske kiseline (organska faza) i heksametilendiamina-1, 6 (odnosno vodene faze). Debljina membrane se izračunava u stotinkama mikrometra. Veličina kapsula je stotine ili desetke mikrometara.
Ugradnja u liposome
Ova metoda imobilizacije bliska je mikrokapsulaciji. Liposomi su predstavljeni u lamelarnim ili sfernim sustavima lipidnih dvoslojeva. Ova metoda je prvi put korištena 1970. Za izolaciju liposoma iz otopine lipida, organsko otapalo se ispari. Preostali tanki film se rasprši u vodenoj otopini u kojoj je enzim prisutan. Tijekom tog procesa dolazi do samosastavljanja lipidnih dvoslojnih struktura. Takvi imobilizirani enzimi prilično su popularni u medicini. To je zbog činjenice da je većina molekula lokalizirana u lipidnom matriksu bioloških membrana. Imobilizirani enzimi uključeni u liposome najvažniji su istraživački materijal u medicini, koji omogućuje proučavanje i opisivanje obrazaca vitalnih procesa.
Stvaranje novih obveznica
Imobilizacija stvaranjem novih kovalentnih lanaca između enzima i nosača smatra se najrasprostranjenijom metodom za dobivanje industrijskih biokatalizatora.odredište. Za razliku od fizikalnih metoda, ova opcija osigurava nepovratnu i jaku vezu između molekule i materijala. Njegovo stvaranje često je popraćeno stabilizacijom lijeka. Istodobno, položaj enzima na udaljenosti 1. kovalentne veze u odnosu na nosač stvara određene poteškoće u provedbi katalitičkog procesa. Molekula je odvojena od materijala pomoću umetka. Često se koristi kao poli- i bifunkcionalna sredstva. Konkretno, to su hidrazin, cijanogen bromid, glutarni diahedrid, sulfuril klorid, itd. Na primjer, da bi se uklonila galaktoziltransferaza, sljedeća sekvenca je umetnuta između nosača i enzima -CH2- NH-(CH 2)5-CO-. U takvoj situaciji u strukturi su prisutni umetak, molekula i nosač. Svi su oni povezani kovalentnim vezama. Od temeljne važnosti je potreba da se u reakciju uvedu funkcionalne skupine koje nisu bitne za katalitičku funkciju elementa. Dakle, u pravilu su glikoproteini vezani na nosač ne kroz protein, već kroz dio ugljikohidrata. Kao rezultat, dobivaju se stabilniji i aktivniji imobilizirani enzimi.
Celije
Gore opisane metode smatraju se univerzalnima za sve vrste biokatalizatora. To uključuje, između ostalog, stanice, substanične strukture, čija je imobilizacija nedavno postala raširena. To je zbog sljedećeg. Kada su stanice imobilizirane, nema potrebe za izolacijom i pročišćavanjem enzimskih pripravaka ili uvođenjem kofaktora u reakcije. Kao rezultat, postaje moguće dasustavi koji provode višestupanjske kontinuirane procese.
Upotreba imobiliziranih enzima
U veterinarskoj medicini, industriji i drugim gospodarskim sektorima, lijekovi dobiveni gore navedenim metodama prilično su popularni. Pristupi razvijeni u praksi pružaju rješenje problema ciljane dostave lijekova u tijelo. Imobilizirani enzimi omogućili su dobivanje lijekova produljenog djelovanja s minimalnom alergenošću i toksičnošću. Trenutno znanstvenici rješavaju probleme povezane s biokonverzijom mase i energije koristeći mikrobiološke pristupe. U međuvremenu, tehnologija imobiliziranih enzima također daje značajan doprinos radu. Čini se da su izgledi za razvoj prilično široki. Dakle, u budućnosti bi jedna od ključnih uloga u procesu praćenja stanja okoliša trebala imati nove vrste analiza. Konkretno, govorimo o metodama bioluminiscentnih i enzimskih imunoanaliza. Napredni pristupi od posebne su važnosti u preradi lignoceluloznih sirovina. Imobilizirani enzimi mogu se koristiti kao pojačala slabih signala. Aktivni centar može biti pod utjecajem nositelja koji je pod ultrazvukom, mehaničkim stresom ili podložan fitokemijskim transformacijama.
