Boja po Gramu se široko koristi u mikrobiologiji jer je to jedan od najlakših načina razlikovanja bakterija na temelju sastava njihove stanične stijenke. Prema Gramu sve se bakterije mogu podijeliti na gram-pozitivne (Gram (+)) i gram-negativne (Gram (-)). Metoda bojenja po Gramu razvijena je 1884. godine i od tada nije izgubila popularnost, iako je modificirana nekoliko puta.
struktura stanične stijenke
Bojenje po Gramu otkriva je li bakterija Gram-pozitivna ili Gram-negativna. Podjela bakterija na Gram (+) i Gram (-) provodi se u skladu sa strukturom njihove stanične stijenke.
Stanična stijenka sadrži najveću količinu peptidoglikana (mureina) - složene tvari, koja uključuje peptapeptid i glikan. Glikan se sastoji od izmjeničnih ostataka N-acetilglukozamina i N-acetilmuramske kiseline međusobno povezanih β-1,4-glikozidne veze. Peptidoglikan osigurava održavanje oblika stanice, osmotsku zaštitu i antigenske funkcije.
Glavne razlike između Gram-pozitivnih i Gram-negativnih bakterija
Različite bakterije imaju različite debljine sloja peptidoglikana. Kod bakterija koje su klasificirane kao gram-pozitivne kreće se od 15 do 80 nm, dok je kod gram-negativnih od 2 do 8 nm. Istovremeno, Gram-negativne bakterije imaju posebnu strukturu ispod peptidoglikanskog sloja, koju Gram-pozitivne bakterije nemaju – periplazmatski prostor. Taj je prostor ispunjen hidrolitičkim enzimima - β-laktamaza, ribonukleaza 1, fosfataza. Upravo su ti enzimi odgovorni za otpornost gram-negativnih bakterija na mnoge antibiotike.
Gram(-) peptidoglikanski sloj bakterije vezan je za lipopolisaharid, antigensku strukturu koja sadrži endotoksin. U Gram(+) bakterijama, teihoične kiseline obavljaju slične funkcije.
Gram-negativne bakterije imaju dodatnu strukturu - vanjsku membranu.
Suština metode bojenja
Prije nego počnete bojati, pripremaju se razmazi proučavanih bakterija. Da biste to učinili, voda se nakapa na predmetno staklo i tamo se s bakterijskom petljom doda kultura mikroorganizama. Zatim, nakon što se voda potpuno osuši, mrlja se fiksira - staklena pločica se nekoliko puta nosi preko plamena plamenika. Bojenje po Gramu je učinkovitije od bojenja živih bakterija - molekule boje se bolje vežu za mrtve stanice.
Bojenje se radi u nekoliko faza:
- Mali komadi filter papira stavljaju se na fiksni razmaz i izlije se glavna boja - gentian violet ili metilen plavo.
- Nakon 3-5 minuta uklonite filter papir u boji i punite razmaz Lugolovom otopinom 1 minutu. U tom slučaju pripravak potamni.
- Lugolova otopina se ocijedi i bris se tretira čistim etilnim alkoholom: nekoliko kapi se nakapa na preparat, ocijedi nakon 20 sekundi. Postupak se ponavlja 2-3 puta.
- Isperite ispitni predmet destiliranom vodom.
- Proizvedite dodatno bojenje - završite pripremu s fuksinom. Nakon 1-2 minute, boja se ispere.
- Nakon što se voda osuši, pregledajte razmaz pod mikroskopom. Gram-pozitivne bakterije bit će plavo-ljubičaste, Gram-negativne bakterije će biti ružičaste ili crvene.
Uzroci različitih uzoraka bojenja
Kao što je gore opisano, bojanje bakterija po Gramu boji Gram-pozitivne bakterije u plavo-ljubičastu boju, dok po Gramu-negativne bakterije oboji crveno ili ružičasto. Razlog za diferencijalno bojenje bakterija ovom metodom je taj što nakon što topljivi oblik gentian violeta uđe u stanicu, boja prelazi u netopivi oblik joda. Tijekom tretmana bakterija etilnim alkoholom, lipidi se ekstrahiraju iz membrane pod djelovanjem ovog nepolarnog otapala. Membrana tada postaje porozna i više nije značajna prepreka za ispiranje boje. Međutimpeptidoglikan je otporniji na nepolarna otapala, uključujući alkohol. On je taj koji sprječava ispiranje boje, pa bakterije s debelim slojem mureina postaju plavoljubičaste (gram-pozitivne), a nakon tretmana alkoholom ne mijenjaju boju.
Tanki mureinski sloj gram-negativnih bakterija ne može zadržati molekule boje u stanici, pa nakon djelovanja alkohola one postaju bezbojne - boje gram-negativne.
Nakon izlaganja razmaza fuksinu, bakterije obojene po Gramu ostaju plavo-ljubičaste, dok gram-negativne bakterije postaju ružičasto-crvene.
Primjeri Gram(+) i Gram(-) bakterija
Gram-negativne bakterije uključuju cijanobakterije, bakterije sumpora, bakterije željeza, klamidiju, rikecije, octene bakterije, mnoge metilobakterije, tionske bakterije, arsenitobakterije, karboksibakterije.
Bifidobakterije, mnoge vodene bakterije, streptokoke i stafilokoke su Gram-pozitivne.
