Metoda kulture tkiva jedan je od glavnih alata moderne biotehnologije, koji omogućuje rješavanje praktičnih problema fiziologije, biokemije i genetike biljaka. Umjetni uzgoj materijala provodi se pod određenim uvjetima: sterilizacija, kontrola temperature i izlaganje posebnom hranjivom mediju.
Essence
Metoda kulture tkiva je njihovo dugotrajno čuvanje i/ili umjetni uzgoj u laboratorijskim uvjetima na hranjivom mediju. Ova tehnologija vam omogućuje stvaranje biološkog modela za proučavanje različitih procesa u stanicama koje postoje izvan tijela biljaka, ljudi i životinja.
Razmnožavanje kulture biljnog tkiva temelji se na svojstvu totipotentnosti - sposobnosti stanica da se razviju u cijeli organizam. Kod životinja se to ostvaruje samo u oplođenim jajima (s izuzetkom nekih vrsta koelenterata).
Povijest razvoja
Prve pokušaje uzgoja biljnih tkiva napravili su njemački znanstvenici na prijelazu iz 19. u 20. stoljeće. Unatoč tome što su bili neuspješni, formulirano je niz ideja koje su kasnije potvrđene.
Godine 1922., W. Robbins i W. Kotte, neovisno jedan o drugome, uspjeli su uzgajati vrhove korijena kukuruza i rajčice na umjetnom hranjivom mediju. Detaljno proučavanje tehnika kulture stanica i tkiva počelo je 1930-ih. 20. stoljeće R. Gautre i F. White dokazali su da uz periodičnu transplantaciju kultura tkiva u svježi hranjivi medij, one mogu rasti u nedogled.
Do 1959. godine uzgajane su 142 biljne vrste u laboratorijskim uvjetima. U drugoj polovici XX.st. također je počela upotreba dispergiranih (odvojenih) ćelija.
Vrste ispitnog materijala
Postoje 2 glavne vrste kultura biljnog tkiva:
- Proizvedeno bez uništavanja i sa očuvanjem karakterističnih osobina svojstvenih živom organizmu.
- Izvađeno razgradnjom (kemijskom, enzimskom ili mehaničkom) iz primarnog tkiva. Može se formirati iz jedne ili više staničnih kultura.
Po načinu uzgoja razlikuju se sljedeće metode:
- na "sloju za hranjenje", u kojem se dijeljenjem stanica iste biljne vrste luči tvar koja stimulira rast tkiva;
- koristeći sestrinsko tkivo pored kultiviranih stanica;
- upotreba hranjivog medija iz izolirane skupine stanica koje se dijele;
- rast pojedinačnih stanica u mikrokapljici zasićene sastavom.
Uzgoj iz pojedinačnih stanica prepun je određenih poteškoća. Kako bi ih umjetno "natjerali" na podjelu, moraju primiti signal od susjednih, aktivno funkcionalnih stanica.
Jedna od glavnih vrsta tkiva za fiziološka istraživanja je kalus, koji nastaje pod nepovoljnim vanjskim čimbenicima (obično mehaničke ozljede). Oni imaju sposobnost da izgube specifične karakteristike svojstvene izvornom tkivu. Kao rezultat toga, stanice kalusa počinju se aktivno dijeliti i nastaju dijelovi biljke.
Potrebni uvjeti
Uspjeh metode kulture tkiva i stanica ovisi o sljedećim čimbenicima:
- Poštivanje sterilnosti. Za transplantaciju se koriste posebne kutije s dovodom pročišćenog zraka, opremljene ultraljubičastim svjetiljkama. Alati i materijali, odjeća i ruke osoblja trebaju biti podvrgnuti aseptičkoj obradi.
- Upotreba posebno odabranih hranjivih medija koji sadrže izvore ugljika i energije (obično saharozu i glukozu), mikro- i makronutrijente, regulatore rasta (auksini, citokinini), vitamine (tiamin, riboflavin, askorbinsku i pantotensku kiselinu i druge).
- Usklađenost s temperaturom (18-30°C), svjetlosnim uvjetima i vlagom (60-70%). Većina kultura tkiva kalusa uzgaja se pod ambijentalnim svjetlom jer ne sadrže kloroplaste, ali neke biljke zahtijevaju pozadinsko osvjetljenje.
Trenutno gotovakomercijalni sastavi (Murasige i Skoog, Gamborg i Eveleg, White, Kao i Mikhailyuk i drugi).
Za i protiv
Prednosti metode kulture stanica i tkiva su:
- dobra ponovljivost dobivenih rezultata;
- regulacija međustaničnih interakcija;
- niska potrošnja reagensa;
- genetska homogenost staničnih linija;
- mogućnost mehanizacije procesa uzgoja;
- kontrola nad uvjetima u kavezu;
- pohrana živih kultura na niskoj temperaturi.
Nedostatak ove biotehnologije je:
- potrebno se pridržavati strogih uvjeta asepse;
- nestabilnost svojstava stanica i mogućnost njihovog nepoželjnog miješanja;
- visoka cijena kemikalija;
- nepotpuna ekvivalentnost kultiviranih tkiva i stanica u živom organizmu.
Prijava
Metoda kulture tkiva korištena za istraživanje:
- procesi unutar stanica (sinteza DNA, RNA i proteina, metabolizam i utjecaj na njega uz pomoć lijekova);
- međustanične reakcije (prolazak tvari kroz stanične membrane, rad hormonsko-receptorskog kompleksa, sposobnost stanica da se prianjaju jedna na drugu, stvaranje histoloških struktura);
- interakcije s okolinom (apsorpcija hranjivih tvari, prijenos infekcija, procesi nastanka i razvojatumori i drugi);
- rezultati genetskih manipulacija sa stanicama.
Obećavajuća područja biologije i farmakologije u čijem se razvoju koristi ova tehnologija su:
- dobivanje učinkovitih herbicida, regulatora rasta za agronomske usjeve, biološki aktivnih spojeva za upotrebu u proizvodnji lijekova (alkaloidi, steroidi i drugi);
- usmjerena mutageneza, uzgoj novih hibrida, prevladavanje postgamne nekompatibilnosti;
- klonsko razmnožavanje, što vam omogućuje da dobijete veliki broj genetski identičnih biljaka;
- uzgoj biljaka otpornih na viruse i bez virusa;
- krioprezervacija genskog fonda;
- rekonstrukcija tkiva, stvaranje izvora matičnih stanica (tkivni inženjering).
