Uzgoj bakterija: metode, principi, koraci i uvjeti

2024 Autor: Angel Austin | [email protected]. Zadnja promjena: 2023-12-17 05:28

Mikroorganizmi u prirodi oko nas su posvuda: u tlu, vodenim tijelima, na površinama raznih objekata, ljudi i životinje su nastanjeni njima. Sve to može poslužiti kao izvor mikrobne kontaminacije hrane, lijekova i proizvodnih linija. Uzgoj bakterija je neophodan za proučavanje njihovih svojstava, potreba i karakteristika. Ovo je pak važan korak u razvoju raznih lijekova, laboratorijskoj dijagnostici bolesti, proračunu proizvodnih reaktora i još mnogo toga.

Opći koncepti

Uzgoj bakterija u mikrobiologiji odnosi se na uzgoj mikroorganizama koji se provodi u laboratoriju. Zauzvrat, mikrobi koji su narasli na odabranom hranjivom mediju nazivaju se kultura. Kulture se mogu miješati ako ih tvore različite vrste mikroorganizama, a čiste ako ih predstavlja samo jedna vrsta bakterija.

Ako je nutritivnaU medij se stavlja samo jedna stanica, a kao rezultat njezine reprodukcije dobiva se skupina jedinki, tada se ovaj skup mikroorganizama naziva klon. Kada se klon razvije do točke u kojoj postaje vidljiv golim okom, ova zbirka bakterija naziva se kolonija.

Obično se uzgoj bakterija izoliranih iz različitih izvora provodi odvojeno jedna od druge. Svaka takva zasebno uzgojena skupina mikroba naziva se soj. Dakle, ako je jedna vrsta stafilokoka izolirana iz tri izvora (ili različitih dijelova istog proizvoda, različitih ljudi), govore o tri soja ove vrste stafilokoka.

Čimbenici rasta bakterija

Uključuju razne aminokiseline, lipide, purinske baze i druge spojeve neophodne za razvoj mikroorganizama. Neki mikrobi mogu samostalno proizvesti tvari koje su im potrebne, dok ih drugi trebaju primiti u gotovom obliku. Prema potrebama mikroorganizama u pojedinim faktorima rasta provodi se identifikacija i diferencijacija bakterija. Također, ovaj parametar je važan za ispravnu pripremu hranjivog medija za laboratorijske i biotehnološke radove:

• Aminokiseline. Bakterije mogu zahtijevati jednu određenu aminokiselinu ili skupinu kiselina. Dakle, klostridijama je potreban leucin i tirozin, streptokokama leucin i arginin. Mikroorganizmi kojima su za rast potrebne aminokiseline izvana nazivaju se auksotrofi.
• Purinske i pirimidinske baze, kao i njihovi derivati (adenin, gvanin i drugi). Oni su važan čimbenik u rastu mnogihVrsta streptokoka.
• Vitamini. Oni su dio koenzima potrebnih bakterijama. Dakle, nikotinska kiselina, kao i njezin amid, koji su dio NAD i NADP, potrebna je difteriji i shigella corynebacterijama. Tiamin, kao sastavni dio pirofosfata, potreban je Staphylococcus aureus, pneumococcus, brucella. Pantotenska kiselina, koja je dio koenzima CoA, potrebna je bacilima tetanusa i određenim vrstama streptokoka. Citokromi, a time i folna kiselina, hemovi i biotin koji ih tvore, neophodni su za Mycobacterium tuberculosis i Haemophilus influenzae.

Zahtjevi za okoliš

Uvjeti za podloge za uzgoj bakterija:

1. Prehrana. Moraju sadržavati tvari, štoviše, u lako probavljivom obliku, potrebne mikroorganizmima za prehranu i obnavljanje energije. To uključuje organogene i minerale. Neki mikroorganizmi dodatno zahtijevaju vitamine i aminokiseline koje ne mogu sintetizirati.
2. Optimalna pH razina. Utječe na propusnost stanične membrane i, sukladno tome, sposobnost apsorpcije hranjivih tvari od strane bakterije. Najčešće bi pH vrijednost trebala biti na razini 7, 2–7, 4. Mnogi mikroorganizmi tijekom svog života proizvode produkte kisele ili alkalne reakcije, a kako se pH hranjivog medija ne bi mijenjao, mora biti u međuspremniku.
3. Izotoničan. Osmotski tlak u hranjivom mediju za uzgoj bakterija trebao bi imati iste vrijednosti kaounutar mikrobnih stanica. Obično odgovara 0,5% otopini NaCl.
4. Sterilnost. To je zbog činjenice da će pojava stranih bakterija iskriviti rezultate proučavanja analiziranog soja.
5. Razina vlažnosti. Ovaj pokazatelj, zajedno s konzistencijom medija, trebao bi imati optimalne karakteristike za određenu vrstu bakterija.
6. Redoks potencijal (RH2). Prikazuje omjer tvari koje doniraju i prihvaćaju elektrone, kao i razinu zasićenosti kisikom hranjivog medija. Za aerobe i anaerobe, uvjeti za uzgoj bakterija donekle se razlikuju u ovom pokazatelju. Anaerobni mikroorganizmi se najbolje razmnožavaju pri vrijednostima RH2 ispod 5, a aerobni mikroorganizmi najmanje 10.
7. Uniformitet. Važno je da medij kulture sadrži stalne količine svojih pojedinačnih sastojaka. Osim toga, preferiraju se jasna rješenja koja olakšavaju praćenje rasta usjeva ili primjećuju kontaminaciju.

Vrste kulturnih medija

Na izbor određenog medija za uzgoj mikroorganizama utječu mnogi čimbenici, među kojima su karakteristike njihove prehrane i svrha istraživanja. Glavne značajke na kojima se temelji klasifikacija hranjivih medija su:

1. Komponente. Prema početnim tvarima korištenim za stvaranje supstrata razlikuju se:

• prirodni, koji se pripremaju od proizvoda životinjskog ili biljnog podrijetla (npr. meso, mlijeko, voće) i pogodni su za uzgoj miješanihusjevi;
• polusintetički, u kojem se skupi prirodni prehrambeni proizvodi zamjenjuju neprehrambenim proizvodima (primjerice, koštano brašno, krvni ugrušci), a koji su optimalni za uzgoj određenih vrsta bakterija ili izolaciju njihovih metaboličkih proizvoda iz okoliš;
• sintetički, koji se pripremaju od preciznih količina kemijskih spojeva, imaju poznat konstantan sastav i lako se mogu reproducirati.

2. Konzistencija (gustoća). Razlikovanje okruženja:

• tekućina;
• gusto;
• polutekućina.

Zadnje dvije pripremljene su od posebnih otopina ili tekućih tvari uz dodatak agar-agara ili želatine za stvaranje potrebne gustoće. Osim toga, gusto okruženje za rast bakterija je zgrušani krvni serum, krumpir, medij silika gela, karagenan.

3. Spoj. Na osnovu toga, okruženja su:

• jednostavno, popis koji je kratak je Meat Pepton Broth (MBB), Hottinger Broth and Agar, Meat Pepton Agar (MPA), hranjiva želatina i peptonska voda.
• složeno, pripremljeno od jednostavnih s dodatkom krvi, sirutke, ugljikohidrata i drugih tvari.

4. Ugovoreni sastanak. Razlikuju se sljedeći hranjivi mediji:

• main se koriste za uzgoj mnogih patogenih mikroba (obično jednostavnog sastava);
• posebne se koriste za izolaciju i uzgoj bakterija koje ne rastu na jednostavnim podlogama;
• selektivni (također su selektivni) prikladni su za izolaciju određene vrste bakterija i inhibiraju rast pridruženih mikroba (selektivnostnastao dodavanjem određenih tvari u medije, kao što su antibiotici ili soli, ili podešavanjem pH);
• diferencijalna dijagnostika omogućuje razlikovanje jedne vrste bakterija od druge procjenom enzimske aktivnosti, na primjer, medija;
• za početnu inokulaciju s naknadnim transportom uzoraka potrebni su konzervansi, jer sprječavaju smrt mikroorganizama, kao i inhibiraju rast drugih bakterija.

Priprema medija

Najvažniji korak u uzgoju anaerobnih bakterija je priprema odgovarajućeg hranjivog medija. Nakon odabira optimalnih parametara, prijeđite na sljedeće faze:

• vaganje, odabirom uzorka komponenti na analitičkoj vagi;
• otapanje se provodi u destiliranoj vodi zagrijanoj na 70°C, a fosfati, mikro- i makrosoli se odvojeno otapaju;
• kuhanje u vodenoj kupelji dvije minute;
• određivanje pH pomoću indikatorskog papira ili potenciometra;
• filtracija kroz filtere od mokre tkanine ili papira za tekuće, kao i rastaljene guste medije, i kroz filter od pamučne gaze za agar medij;
• punjenje izvedeno na 3/4 kapaciteta;
• srednje ovisna sterilizacija;
• kontrola sterilnosti provodi se odležavanjem dva dana u termostatu, nakon čega slijedi pregled;
• kemijska kontrola za utvrđivanje pH i sadržaja potrebnogstavke;
• biološka kontrola probnom inokulacijom.

Sterilizacija staklenog posuđa i medija

Jedan od osnovnih principa uzgoja bakterija je sterilnost. Rast i razvoj stranih mikroorganizama može utjecati na karakteristike hranjivog medija mijenjajući njegov kemijski sastav i pH. Sterilizacija je glavni uvjet za uzgoj čistih kultura. U praksi ovaj pojam označava metode uništavanja apsolutno svih oblika života na površini iu volumenu steriliziranih predmeta. Posude, korišteni instrumenti, mediji i drugi predmeti korišteni tijekom studije sterilizirani su.

Neke vrste sterilizacije:

• Paljenje. Sterilizacija petlji i iglica za sjetvu, staklenih stakala, nekih instrumenata može se izvesti plamenikom ili špiritusom.
• Krenje. Pogodno za rukovanje špricama, iglama, hranom, ali ne ubija spore bakterija.
• Sterilizacija suhom toplinom. Izvodi se u posebnom ormaru za sušenje i pogodan je za obradu tikvica, epruveta i ostalog laboratorijskog staklenog posuđa.
• Sterilizacija parom. Izvedena u autoklavu, ova metoda je vrlo učinkovita. Ali nije prikladan za hranjive medije koji sadrže proteine ili bilo koje druge spojeve koji se razgrađuju na visokim temperaturama. Štedljivije se može nazvati tindalizacijom. Izvodi se u Koch kotlu i kombinira klijanje spora s njihovim uništavanjem.
• Pasterizacija. Koristi se za medije koji mijenjaju svojstva kuhanjem (npr. mlijeko, vino, pivo), sposobne zaosloboditi ih od mikroorganizama koji ne nose spore. Temperatura obrade je samo 50-60 ° C u trajanju od petnaest do trideset minuta. U nekim slučajevima koristi se hladna sterilizacija, koja se provodi pomoću filtera ili UV zraka.

Uvjeti uzgoja bakterija

Rast i razvoj bakterija moguć je samo pod određenim čimbenicima i vrijednostima svakog od njih:

1. Temperatura. Postoje tri skupine bakterija koje se razlikuju po preferencijama temperature:

• termofili, ili mikrobi koji vole toplinu, rastu na 45-90°C, što znači da se ne razmnožavaju u ljudskim i životinjskim organizmima;
• psihrofili, ili mikroorganizmi koji vole hladnoću, preferiraju temperature u rasponu od 5-15°C i uzgajaju se u hladnjačama;
• mezofili, razvijaju se na temperaturi od 25-37°C, uključuju većinu bakterija.

2. Svjetlo. To je značajka uzgoja fototrofnih bakterija, budući da one provode proces fotosinteze. Ali za većinu mikroba rasvjeta nije preduvjet. Pa čak i obrnuto, solarno ultraljubičasto može suzbiti njihov razvoj.

3. Voda. Svim mikroorganizmima je potrebna voda u dostupnom (tekućem) obliku. Zato smrznuta hrana ima mali ili nikakav rast bakterija.

4. Kiselost okoliša. Ovaj princip uzgoja bakterija je već detaljno razmotren gore.

5. Prozračivanje. Kisik je kao kemijski element sastavni dio vode i znatan broj spojeva koji se koristeuzgoj mikroorganizama. Plinoviti kisik također može biti sadržan u vodi i drugim tekućinama u otopljenom obliku. Značajan dio bakterija treba stalnu opskrbu molekulama kisika. Ali za brojne mikroorganizme to je nepotrebno, ili, još gore, plinoviti kisik je otrovan za njih, budući da nemaju katalazu i peroksidazu, koje uništavaju otrovne produkte dišnog sustava. Stoga je najvažniji korak u uzgoju anaerobnih bakterija uklanjanje O₂ molekula iz hranjivog medija.

6. Uzgoj mikroorganizama. Uzgoj aerobnih i anaerobnih bakterija provodi se u različitim slojevima okoliša i na različite načine.

Uzgoj aerobnih mikroorganizama

Uzgoj aerobnih bakterija zahtijeva molekularni kisik. Za dobivanje čistih kultura aeroba koje se mogu uspješno koristiti u medicini i prehrambenoj industriji koriste se sljedeće metode:

• površina koja raste na gustom mediju ili u tekućem mediju (njihov tanak sloj) kada kisik dolazi izravno iz zraka;
• duboka kultivacija u tekućim medijima, kada se stalnim prozračivanjem postiže povećanje količine kisika otopljenog u njima.

Uzgoj anaerobnih mikroorganizama

Osnovni princip uzgoja bakterija ove vrste je njihov minimalni kontakt s atmosferskim kisikom. Osigurati uvjete za njihov rast mnogo je teže nego za aerobe. Sljedeće metode se koriste za izolaciju anaeroba iz molekularnog O₂:

1. Fizički. Ovaj način uzgoja anaerobnih bakterija svodi se na njihov uzgoj u posebnom vakuumskom aparatu - mikroanaerostatu. Zrak u njemu zamijenjen je posebnom plinskom mješavinom dušika s dodatkom 10% vodika i 5% ugljičnog dioksida.
2. Kemijska. To uključuje: korištenje upijajućih sredstava (npr. Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) ili reduktori (kao što je askorbinska kiselina).
3. Biološka. Svodi se na zajedničko uzgoj aeroba i anaeroba u zatvorenom sustavu. Ova metoda uzgoja bakterija podrazumijeva zasijavanje jedne polovice Petrijeve zdjelice nekom od aerobnih vrsta bakterija, a druge polovice proučavanim anaerobom. Njegov razvoj će započeti u trenutku kada se potroši sav kisik.

Sljedeće metode sjetve prikladne su za uzgoj anaerobnih bakterija:

• u površinskom sloju;
• u površinskom sloju ispunjenom sterilnim parafinom;
• u debljini gustog hranjivog medija;
• u dubokim slojevima viskoznih medija.

Dobivanje čiste kulture

Mikrobiolozi obično rade s uzorcima u kojima živi mnogo različitih vrsta mikroba. Međutim, za određivanje sustavnog položaja mikroorganizama (obitelj, rod, vrsta), kao i za proučavanje njihovih karakteristika, potrebno ih je izolirati i uzgajati čistu kulturu. Od velike su važnosti u mnogim prehrambenim industrijama, na primjer, sir, kruh, kvas, vino itd. Uzgoj bakterija mliječne kiseline omogućuje dobivanjebitna komponenta za proizvodnju fermentiranih mliječnih proizvoda, tijesta, kakaa, silaže, pa čak i plastike.

Metoda izolacije čiste kulture u gustom mediju temelji se na mehaničkom odvajanju stanica mikroorganizama s njihovim naknadnim izoliranim uzgojem. Uzorak se prenese u sterilni volumen vode ili fiziološke otopine (volumen 10-100 ml) i zatim se mućka dvije minute. Kako bi se izdvojili mikroorganizmi koji se nalaze u debljini ispitivanog materijala (na primjer, kobasice ili sir), prvo se vrši trljanje komada uzorka sterilnim instrumentima pijeskom. Materijal koji je prošao preliminarnu pripremu, težine 1 g ili volumena od 1 ml, razrijedi se sterilnom vodom 10, 100, 1000, itd. puta. Odabire se stupanj razrjeđenja koji daje koncentraciju stanica koja odgovara mogućnostima metode.

Naknadna kultivacija mikroorganizama je priprema hranjivog medija. Obično se bira gusti medij (MPA). Najprije se otopi i ohladi na 45-50 °C, a tek onda se izlije u nekoliko Petrijevih zdjela (tri do pet komada), na čije se dno stavljaju brisevi ispitivane tvari različite koncentracije. Zatim se vrši miješanje još nezamrznutog hranjivog medija i materijala unesenog u njega. Ovako se ćelije fiksiraju na različitim točkama volumena supstrata.

Dalje, Petrijeve zdjelice se stavljaju u termostat na 2 dana na 22 °C. Tijekom tog vremena stanice se umnožavaju do te mjere da kolonija koju formira svaka od stanica postaje vidljiva golim okom. Svaki od njih je čista kultura vrste bakterija iz čijih je stanicaruža.

Nakon toga, iz Petrijevih zdjela, mikroorganizmi se subkulturiraju u zasebne epruvete napunjene hranjivim medijem. Na taj se način iz miješanog uzorka izoliraju čiste kulture. Ova metoda nosi ime svog programera - R. Koch. Uobičajeno se naziva i metoda čašice, ili iscrpljujuća sjetva. Nakon dobivanja čistih kultura različitih vrsta bakterija, određuju se njihov oblik, spore i obitelji.

Svi radovi moraju biti izvedeni u skladu s načelima asepse. Kako bi se izbjegao prijevremeni razvoj mikroorganizama, ispitivanje treba provesti odmah nakon uzorkovanja. Voda iz slavine se analizira nakon pražnjenja prvih porcija, jer mogu sadržavati mikrobe nakupljene u cijevima i slavinama. Mikroflora voća, bobičastog voća i povrća uglavnom se nalazi na površini (kora), pa se s nje izvode ispiranje. Da biste to učinili, stavite fetus u sterilnu posudu i napunite ga potrebnom količinom vode. Zatim se dosta snažno protresu i voda se prelije u drugu posudu. Usjevi od platnenih proizvoda također se dobivaju u brisevima, ali se prethodno iz njih izrezuju komadi određene veličine.