Za razliku od eukariota, bakterije nemaju formiranu jezgru, ali njihova DNK nije raspršena po stanici, već je koncentrirana u kompaktnoj strukturi zvanoj nukleoid. U funkcionalnom smislu, to je funkcionalni analog nuklearnog aparata.
Što je nukleoid
Bakterijski nukleoid je regija u njihovim stanicama koja sadrži strukturirani genetski materijal. Za razliku od eukariotske jezgre, nije odvojena membranom od ostatka staničnog sadržaja i nema trajni oblik. Unatoč tome, genetski aparat bakterija jasno je odvojen od citoplazme.
Sam izraz znači "nalik jezgri" ili "nuklearna regija". Ovu strukturu prvi je otkrio 1890. zoolog Otto Buchli, no njezine razlike u odnosu na genetski aparat eukariota identificirane su već početkom 1950-ih zahvaljujući tehnologiji elektronske mikroskopije. Naziv "nukleoid" odgovara konceptu "bakterijskog kromosoma", ako je potonji sadržan u stanici u jednoj kopiji.
Nukleoid ne uključuje plazmide kojisu ekstrakromosomski elementi bakterijskog genoma.
Obilježja bakterijskog nukleoida
Uobičajeno, nukleoid zauzima središnji dio bakterijske stanice i orijentiran je duž svoje osi. Volumen ove kompaktne formacije ne prelazi 0,5 mikrona3, a molekularna težina varira od 1×109 do 3×109 d alton. U određenim je točkama nukleoid vezan za staničnu membranu.
Bakterijski nukleoid sadrži tri komponente:
- DNA.
- Strukturni i regulatorni proteini.
- RNA.
DNK ima kromosomsku organizaciju koja se razlikuje od eukariotske. Najčešće, bakterijski nukleoid sadrži jedan kromosom ili nekoliko njegovih kopija (s aktivnim rastom njihov broj doseže 8 ili više). Ovaj pokazatelj varira ovisno o vrsti i fazi životnog ciklusa mikroorganizma. Neke bakterije imaju više kromosoma s različitim skupovima gena.
U središtu nukleoidne DNK je prilično čvrsto nabijena. Ova zona je nedostupna ribosomima, enzimima replikacije i transkripcije. Naprotiv, deoksiribonukleinske petlje periferne regije nukleoida u izravnom su kontaktu s citoplazmom i predstavljaju aktivne regije bakterijskog genoma.
Količina proteinske komponente u bakterijskom nukleoidu ne prelazi 10%, što je oko 5 puta manje nego u eukariotskom kromatinu. Većina proteina povezana je s DNK i sudjeluje u njenom strukturiranju. RNA je proizvodtranskripcija bakterijskih gena, koja se provodi na periferiji nukleoida.
Genetski aparat bakterija je dinamična formacija sposobna promijeniti svoj oblik i strukturnu konformaciju. Nedostaju mu jezgre i mitotički aparat karakteristični za jezgru eukariotske stanice.
Bakterijski kromosom
U većini slučajeva, bakterijski nukleoidni kromosomi imaju oblik zatvorenog prstena. Linearni kromosomi su mnogo rjeđi. U svakom slučaju, te se strukture sastoje od jedne molekule DNK, koja sadrži skup gena potrebnih za opstanak bakterija.
Kromosomska DNK je dovršena u obliku superzamotanih petlji. Broj petlji po kromosomu varira od 12 do 80. Svaki kromosom je punopravni replikon, budući da se pri udvostručenju DNK u potpunosti kopira. Ovaj proces uvijek počinje od početka replikacije (OriC), koji je vezan za plazma membranu.
Ukupna duljina molekule DNA u kromosomu je nekoliko redova veličine veća od veličine bakterije, pa je potrebno ju pakirati, ali uz održavanje funkcionalne aktivnosti.
U eukariotskom kromatinu ove zadatke obavljaju glavni proteini - histoni. Bakterijski nukleoid sadrži proteine koji vežu DNK koji su odgovorni za strukturnu organizaciju genetskog materijala, a također utječu na ekspresiju gena i replikaciju DNK.
Proteini povezani s nukleoidima uključuju:
- proteini slični histonu HU, H-NS, FIS i IHF;
- topoizomeraze;
- proteini SMC obitelji.
Zadnje 2 grupe imaju najveći utjecaj na supersvijanje genetskog materijala.
Neutralizaciju negativnih naboja kromosomske DNK provode poliamini i magnezijevi ioni.
Biološka uloga nukleoida
Prije svega, nukleoid je neophodan bakterijama za pohranjivanje i prijenos nasljednih informacija, kao i za njihovo implementiranje na razini stanične sinteze. Drugim riječima, biološka uloga ove formacije je ista kao i DNK.
Ostale funkcije bakterijskih nukleoida uključuju:
- lokalizacija i zbijanje genetskog materijala;
- funkcionalno DNK pakiranje;
- regulacija metabolizma.
Strukturiranje DNK ne samo da omogućuje da molekula stane u mikroskopsku stanicu, već također stvara uvjete za normalan tijek procesa replikacije i transkripcije.
Obilježja molekularne organizacije nukleoida stvaraju uvjete za kontrolu staničnog metabolizma promjenom konformacije DNK. Regulacija se događa izvlačenjem određenih dijelova kromosoma u citoplazmu, što ih čini dostupnima za enzime transkripcije, ili obrnuto, uvlačenjem.
Metode detekcije
Postoje 3 načina za vizualno otkrivanje nukleoida u bakterijama:
- svjetlosna mikroskopija;
- faznokontrastna mikroskopija;
- elektronska mikroskopija.
Ovisno o metodipriprema preparata i metoda istraživanja, nukleoid može izgledati drugačije.
Svjetlosna mikroskopija
Za detekciju nukleoida pomoću svjetlosnog mikroskopa, bakterije se preliminarno boje tako da nukleoid ima boju različitu od ostatka staničnog sadržaja, inače ova struktura neće biti vidljiva. Također je obavezno fiksirati bakterije na stakalcu (u ovom slučaju mikroorganizmi umiru).
Kroz leću svjetlosnog mikroskopa, nukleoid izgleda kao tvorba u obliku graha s jasnim granicama, koja zauzima središnji dio stanice.
Načini bojanja
U većini slučajeva, sljedeće metode bojenja bakterija koriste se za vizualizaciju nukleoida svjetlosnom mikroskopijom:
- prema Romanovsky-Giemsi;
- Felgenova metoda.
Prilikom bojenja prema Romanovsky-Giemsi, bakterije se prethodno fiksiraju na stakalcu s metil alkoholom, a zatim se 10-20 minuta impregniraju bojom iz jednake mješavine azurnog, eoninskog i metilenskog plavog, otopljen u metanolu. Kao rezultat, nukleoid postaje ljubičast, a citoplazma blijedo ružičasta. Prije mikroskopije, mrlja se ocijedi i stakalce se ispere destilatom i osuši.
Feulgenova metoda koristi hidrolizu slabe kiseline. Kao rezultat toga, oslobođena deoksiriboza prelazi u aldehidni oblik i stupa u interakciju s fuksin-sumpornom kiselinom Schiffovog reagensa. Kao rezultat, nukleoid postaje crven, a citoplazma plava.
Mikroskopija faznog kontrasta
Mikroskopija faznog kontrasta imaveća rezolucija od svjetlosti. Ova metoda ne zahtijeva fiksiranje i bojenje pripravka - promatranje se odvija za žive bakterije. Nukleoid u takvim stanicama izgleda kao svijetlo ovalno područje na pozadini tamne citoplazme. Učinkovitija metoda može se napraviti primjenom fluorescentnih boja.
Detekcija nukleoida s elektronskim mikroskopom
Postoje 2 načina za pripremu preparata za ispitivanje nukleoida pod elektronskim mikroskopom:
- ultra-tanki rez;
- Izrežite smrznute bakterije.
Na elektronskim mikrosnimkama ultratankog dijela bakterije, nukleoid ima izgled guste mrežne strukture koja se sastoji od tankih filamenata, koja izgleda svjetlije od okolne citoplazme.
Na dijelu smrznute bakterije nakon imunološkog bojenja, nukleoid izgleda kao struktura nalik koralju s gustom jezgrom i tankim izbočinama koje prodiru u citoplazmu.
Na elektronskim fotografijama nukleoid bakterije najčešće zauzima središnji dio stanice i ima manji volumen nego u živoj stanici. To je zbog izloženosti kemikalijama koje se koriste za fiksiranje pripravka.
