Metode za određivanje molekularne težine proteina su kemijske, fizikalno-kemijske i fizičke. Najčešće fizikalno-kemijske metode su gel kromatografija (i kolona i tankoslojni) i elektroforeza u poliakrilamidnom gel mediju u prisutnosti natrijevog dodecil sulfata. Ne zahtijevaju složenu opremu i velike količine ispitnog materijala.
Karakterizacija proteina
Proteini su polimeri visoke molekularne težine biološkog porijekla. Sastoje se od aminokiselina povezanih u nizu peptidnim vezama. Veličina proteina ovisi o broju tih istih aminokiselina. Prosječne vrijednosti elementarnog sastava proteina u %:
- ugljik - u rasponu od 50, 6-54, 5;
- kisik – unutar 21,5-23,5;
- dušik - oko 15,0-17,6;
- vodik - u rasponu od 6, 5-7, 3;
- sumpor – unutar 0, 3-2, 5;
- mineralne tvari - ne više od 0,5.
Proteini se dijele na jednostavne, koje se sastoje samo od aminokiselinskih ostataka, i složene, uključujući prostetske skupine. Neproteinske komponente mogu biti ugljikohidrati, lipidi, nukleinske kiseline, derivati vitamina, ioni metala, hem, itd. Postoje četiri proteinske strukture.
Sastav aminokiselina proteina se utvrđuje kiselinskom hidrolizom, u kombinaciji s naknadnim odvajanjem oslobođenih aminokiselina korištenjem kromatografije ionske izmjene.
Kvantitativni pokazatelji svake od aminokiselina određuju se ninhidrinskom metodom. Otkrivanje položaja aminokiselina u proteinskoj molekuli provodi se uzastopnim cijepanjem terminalnih aminokiselina uz pomoć enzima i njihovom identifikacijom, što omogućuje određivanje strukture proteinske molekule. Identifikacija se temelji na njihovim različitim fizikalno-kemijskim svojstvima. Često se za to koriste reakcije u boji za određene aminokiseline i kromatografija.
Kolonska gel kromatografija
Ova se metoda temelji na linearnoj ovisnosti logaritma molekularne težine mnogih globularnih proteina i volumena eluiranja s napunjenim gelom (određene veličine pora). Dakle, da bi se odredila molekularna težina proteina, treba samo pronaći volumen njegovog eluiranja iz prethodno kalibrirane kolone. Kalibracija se provodi propuštanjem proteina s unaprijed određenim masama molekula kroz kolonu i mjerenjem volumena eluiranja svake od njih. Ako se Sephadex G-75 koristi kao punilo, tada se izračun molekularne težine provodi prema jednadžbi koja je eksperimentalno pronađena:
lg M=5, 624 – 0, 752 (Ve / Vo), gdje je M željena molekulatežina; Ve – volumen otopine s ispitivanom tvari koja napušta kolonu; Vo – slobodan volumen stupca.
Za analizu će vam trebati otopina plavog dekstrana (1%), otopina NaCl (0,1 mol/l), Sephadex G-75 (4 g), otopina hemoglobina (1%).
Izvrši analizu
Pripremljena kolona se napuni Sephadex G-75 gelom i ispere otopinom NaCl. Nakon što se otopina NaCl koja se diže iznad razine gela iscijedi, na njenu površinu pažljivo se stavi 0,5 ml otopine plavog dekstrana. Zatim se tekućine koje napuštaju kolonu skupljaju u graduirani cilindar, gdje se čuvaju do kraja eksperimenta. U unaprijed pripremljene epruvete skuplja se otopina plave boje koja počinje istjecati u 20 kapi. Eluat iz njih, od prve do najintenzivnije obojene, ulijeva se u isti gradirani cilindar, u kojem su već sakupljene neobojene frakcije. Volumen epruveta blijedih boja otopine se ne uzima u obzir.
Zapremina tekućine prikupljene u graduiranom cilindru je slobodni volumen kolone (Vo). Zatim se ponavlja punjenje kolone, ali umjesto plavog dekstrina koristi se otopina hemoglobina. Volumen eluata u mjernom cilindru do oslobađanja otopine s maksimalno ružičastom bojom je vrijednost Ve. Pronađene vrijednosti Vo i Ve zamjenjuju se u odgovarajuću jednadžbu i izračunava se masa proteina. Sastav aminokiselina proteina nalazi se sličnim metodama.
Toslojni gel-kromatografija
Princip ove metode leži u činjenici da se tijekom napredovanja otopine proteina na ploči s najtanjim slojem Sephadexa njihova smjesa neravnomjerno raspoređuje. Iz udaljenosti koju je svaki od proteina priješao od izvorne početne linije, pronađite logaritme njihove molekularne težine. Kako bi se odredila molekularna težina proteina tankoslojnom gel kromatografijom, konstruira se kalibracijski grafikon koji odražava ovisnost udaljenosti prijeđenih proteina markera o logaritmima njihove molekularne mase. Već pomoću njega pronađena je duljina puta proteina koji se proučava i masa njegove molekule.
Za izvođenje eksperimenta trebat će vam pozornica s promjenjivim kutom nagiba, kao i kromatografska komora. Od reagensa, trebat će vam Sephadex G-200 ili G-150, natrijev fosfatni pufer, pH 7,4 (0,1 mol/l), otopina bromofenol plavog (0,1%), CH 3otopinaCOOH (5%), CH3COONa otopina (2%), komplet proteinskih markera, kromatografski papir.
Izvođenje eksperimenta
Prvo je potrebno pripremiti Sephadex gel, za koji se njegova suha masa od 4 g suspendira u suvišnoj količini natrijevog fosfatnog pufera, a zatim ostavi da bubri 3 dana na n.o. Staklena ploča sa stranicama 20x40 cm temeljito se opere. Prije nanošenja Sephadexa, pufer iznad njega se dekantira, a zatim se gel dobro promiješa. Porculanskom žlicom se nanosi na vodoravno smješten tanjur, a zatim raspoređuje motanjem staklenog štapića veličine 1x22 cm. Valjanje se ponavlja dok se ravnomjerno ne rasporedi sloj gela bez grudica i mjehurića debljine 1 mm. Pripremljena ploča se suši na zraku 15 minuta, a zatim stavlja u kromatografsku komoru.
Fosfatni pufer se izlije u vanjske posude, gel se kombinira s puferom s kromatografskim papirom. Zatim se komora zatvara i stavlja na poseban stalak. Kut njegovog nagiba postavljen je na 7-10°. Ostavite komoru preko noći da se zasiti.
Otopine proteina čija je molekularna masa poznata, kao i uzorci koji se proučavaju, apliciraju se mikropipetom, volumen svake porcije treba biti 0,02 ml. Ploča se vraća u vodoravni položaj i dijelovi proteina se nanose na određene točke. Udaljenost između njih i od gornjeg ruba treba biti 3 cm. Zatim se komora zatvori i postavi pod kutom od 7-10 °. Gel kromatografska analiza provodi se 4 sata.
Nakon predviđenog vremena, kamera se postavlja vodoravno, a kromatografski papir se uklanja. Staklena ploča se postavlja na postolje u vodoravnom položaju i izrađuje se “replika” na kromatografskom papiru. Da biste to učinili, smota se u cijev i nanese na tanki sloj gela, postupno se otvara. U tom slučaju, papir bi se trebao zalijepiti za njega, ali to morate učiniti pažljivo kako bi ostao netaknut. Papir se ostavi na površini ploče 1 minutu, nakon čega se suši na temperaturi od 90 °C 20 minuta. i stavljen u posebnu posudu za bojenje.
Transkript rezultata
Da bi se identificirale proteinske zone, "replika" se stavlja u otopinu bromofenol plavog na 3 minute. Unaprijeditiboja se mora dvaput isprati otopinom octene kiseline i fiksirati s natrijevim acetatom. Nakon toga se kromatografski papir temeljito ispere u hladnoj tekućoj vodi i osuši. Zatim počinju mjeriti udaljenost koju svaki protein prijeđe od početne točke do središta točke.
Prema dobivenim podacima, kalibracijski grafikon se gradi crtanjem duž apscisne osi la/lst (gdje je indeks a odnosi se na analizirani, a st - na standardni protein), duž y-osi - lgM. Mjerenjem udaljenosti proteinske regije testnog uzorka od početka, molekularna težina i predložena struktura proteinske molekule određuju se pomoću nacrtanog grafikona.
