Protein je bitna komponenta svih organizama. Svaka njegova molekula sastoji se od jednog ili više polipeptidnih lanaca koji se sastoje od aminokiselina. Iako su informacije potrebne za život kodirane u DNA ili RNA, rekombinantni proteini obavljaju širok raspon bioloških funkcija u organizmima, uključujući enzimsku katalizu, zaštitu, potporu, kretanje i regulaciju. Prema njihovim funkcijama u tijelu, te se tvari mogu podijeliti u različite kategorije, kao što su antitijela, enzimi, strukturna komponenta. S obzirom na njihove važne funkcije, takvi su spojevi intenzivno proučavani i široko korišteni.
U prošlosti je glavni način dobivanja rekombinantnog proteina bio izolirati ga iz prirodnog izvora, što je obično neučinkovito i dugotrajno. Nedavni napredak u biološkoj molekularnoj tehnologiji omogućio je kloniranje DNK koja kodira određeni skup tvari u ekspresijski vektor za tvari kao što su bakterije, kvasac, stanice insekata i stanice sisavaca.
Jednostavno rečeno, rekombinantni proteini se prevode egzogenim DNK proizvodima užive stanice. Njihovo dobivanje obično uključuje dva glavna koraka:
- Kloniranje molekule.
- Izraz proteina.
Trenutno je proizvodnja takve strukture jedna od najmoćnijih metoda koje se koriste u medicini i biologiji. Kompozicija ima široku primjenu u istraživanju i biotehnologiji.
Medicinski smjer
Rekombinantni proteini pružaju važne tretmane za različite bolesti kao što su dijabetes, rak, zarazne bolesti, hemofilija i anemija. Tipične formulacije takvih tvari uključuju antitijela, hormone, interleukine, enzime i antikoagulanse. Sve je veća potreba za rekombinantnim formulacijama za terapijsku upotrebu. Omogućuju vam da proširite metode liječenja.
genetski modificirani rekombinantni proteini igraju ključnu ulogu na tržištu terapijskih lijekova. Stanice sisavaca trenutno proizvode najviše terapeutskih sredstava jer su njihove formulacije sposobne proizvesti visokokvalitetne, prirodne tvari. Osim toga, mnogi odobreni rekombinantni terapeutski proteini proizvode se u E. coli zbog dobre genetike, brzog rasta i visoke produktivnosti. Također ima pozitivan učinak na razvoj lijekova na bazi ove tvari.
Istraživanje
Dobivanje rekombinantnih proteina temelji se na različitim metodama. Tvari pomažu otkriti osnovne i temeljne principe tijela. Te se molekule mogu koristiti za identifikaciju i određivanjemjesto tvari kodirane određenim genom i otkrivanje funkcije drugih gena u različitim staničnim aktivnostima kao što su signalizacija stanica, metabolizam, rast, replikacija i smrt, transkripcija, translacija i modifikacija spojeva o kojima se raspravlja u članku.
Tako se promatrani sastav često koristi u molekularnoj biologiji, biologiji stanica, biokemiji, strukturnim i biofizičkim studijama i mnogim drugim područjima znanosti. Istovremeno, dobivanje rekombinantnih proteina je međunarodna praksa.
Takvi spojevi su korisni alati u razumijevanju međustaničnih interakcija. Pokazali su se učinkovitima u nekoliko laboratorijskih metoda kao što su ELISA i imunohistokemija (IHC). Rekombinantni proteini mogu se koristiti za razvoj enzimskih testova. Kada se koriste u kombinaciji s parom odgovarajućih antitijela, stanice se mogu koristiti kao standardi za nove tehnologije.
Biotehnologija
Rekombinantni proteini koji sadrže sekvencu aminokiselina također se koriste u industriji, proizvodnji hrane, poljoprivredi i bioinženjeringu. Na primjer, u stočarstvu, enzimi se mogu dodati hrani kako bi se povećala nutritivna vrijednost sastojaka hrane za životinje, smanjili troškovi i otpad, podržalo zdravlje crijeva životinja, poboljšala produktivnost i poboljšala okoliš.
Osim toga, bakterije mliječne kiseline (LAB) dugo vremenakorišteni su za proizvodnju fermentirane hrane, a nedavno je razvijen LAB za ekspresiju rekombinantnih proteina koji sadrže sekvencu aminokiselina, koja se može široko koristiti, na primjer, za poboljšanje probave ljudi, životinja i hrane.
Međutim, ove tvari također imaju ograničenja:
- U nekim slučajevima, proizvodnja rekombinantnih proteina je složena, skupa i dugotrajna.
- Tvari proizvedene u stanicama možda ne odgovaraju prirodnim oblicima. Ova razlika može smanjiti učinkovitost terapijskih rekombinantnih proteina i čak uzrokovati nuspojave. Osim toga, ova razlika može utjecati na rezultate eksperimenata.
- Glavni problem sa svim rekombinantnim lijekovima je imunogenost. Svi biotehnološki proizvodi mogu pokazati neki oblik imunogenosti. Teško je predvidjeti sigurnost novih terapijskih proteina.
Općenito, napredak u biotehnologiji povećao se i olakšao proizvodnju rekombinantnih proteina za razne primjene. Iako još uvijek imaju neke nedostatke, tvari su važne u medicini, istraživanju i biotehnologiji.
veza za bolest
rekombinantni protein nije štetan za ljude. Ona je samo sastavni dio ukupne molekule u razvoju pojedinog lijeka ili nutritivnog elementa. Mnoge medicinske studije pokazale su da je prisilna ekspresija proteina FGFBP3 (skraćeno BP3) u laboratorijskom soju pretilih miševa pokazala značajno smanjenje njihove tjelesne masti.mase, unatoč genetskoj predispoziciji za korištenje.
Rezultati ovih ispitivanja pokazuju da protein FGFBP3 može ponuditi novu terapiju za poremećaje povezane s metaboličkim sindromom kao što su dijabetes tipa 2 i bolest masne jetre. No budući da je BP3 prirodni protein, a ne umjetni lijek, klinička ispitivanja rekombinantnog humanog BP3 mogla bi započeti nakon posljednjeg kruga pretkliničkih studija. Na, odnosno, postoje razlozi vezani za sigurnost provođenja takvih studija. Rekombinantni protein nije štetan za ljude zbog postupne obrade i pročišćavanja. Promjene se događaju i na molekularnoj razini.
PD-L2, jedan od ključnih igrača u imunoterapiji, nominiran je za Nobelovu nagradu za fiziologiju i medicinu 2018. Ovaj rad, koji su započeli prof. James P. Allison iz SAD-a i prof. Tasuku Honjo iz Japana, doveo je do liječenja karcinoma poput melanoma, raka pluća i drugih na temelju imunoterapije na kontrolnim točkama. Nedavno je AMSBIO dodao veliki novi proizvod svojoj imunoterapijskoj liniji, aktivator PD-L2/TCR - CHO rekombinantna stanična linija.
U eksperimentima s dokazom koncepta, istraživači sa Sveučilišta Alabama u Birminghamu, predvođeni H. Long Zhengom, MD, profesorom Robertom B. Adamsom, i direktorom laboratorijske medicine, Odjel za patologiju, UAB School of Medicina, istaknuli su potencijalnu terapiju rijetkog, ali smrtonosnog poremećaja krvarenja, TTP.
Rezultati ovogastudije po prvi put pokazuju da transfuzija trombocita napunjenih rADAMTS13 može biti novi i potencijalno učinkovit terapijski pristup za arterijsku trombozu povezanu s kongenitalnom i imunološki posredovanom TTP.
Rekombinantni protein nije samo nutrijent, već i lijek u sastavu lijeka koji se razvija. Ovo su samo neka područja koja su danas uključena u medicinu i koja se odnose na proučavanje svih njezinih strukturnih elemenata. Kao što pokazuje međunarodna praksa, struktura tvari omogućuje na molekularnoj razini rješavanje mnogih ozbiljnih problema u ljudskom tijelu.
Razvoj cjepiva
Rekombinantni protein je specifičan skup molekula koji se može modelirati. Slično svojstvo koristi se u razvoju cjepiva. Nova strategija cijepljenja, također poznata kao korištenje posebne injekcije rekombinantnog virusa, mogla bi zaštititi milijune pilića u riziku od ozbiljne respiratorne bolesti, rekli su istraživači sa Sveučilišta u Edinburghu i Instituta Pirbright. Ova cjepiva koriste bezopasne ili slabe verzije virusa ili bakterije za unos klica u stanice tijela. U ovom slučaju, stručnjaci su koristili rekombinantne viruse s različitim spike proteinima kao cjepiva kako bi stvorili dvije verzije bezopasnog virusa. Postoji mnogo različitih lijekova izgrađenih oko ove veze.
Trgovački nazivi i analozi rekombinantnih proteina su sljedeći:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "Eylea".
Ovo su uglavnom lijekovi protiv raka, ali postoje i druga područja liječenja povezana s ovom aktivnom tvari.
Novo cjepivo, također nazvano LASSARAB, dizajnirano da zaštiti ljude i od Lassa groznice i od bjesnoće, pokazalo je obećavajuće rezultate u pretkliničkim studijama, prema novoj studiji objavljenoj u znanstvenom časopisu Nature Communications. Kandidat za inaktivirano rekombinantno cjepivo koristi oslabljeni virus bjesnoće.
Istraživački tim ubacio je genetski materijal Lassa virusa u vektor virusa bjesnoće kako bi cjepivo eksprimiralo površinske proteine u Lassa i stanicama bjesnoće. Ovi površinski spojevi izazivaju imunološki odgovor protiv infektivnih agenasa. Ovo cjepivo je potom inaktivirano kako bi se "uništio" živi virus bjesnoće koji se koristio za stvaranje prijenosnika.
Način dobivanja
Postoji nekoliko sustava za proizvodnju tvari. Opća metoda za dobivanje rekombinantnog proteina temelji se na dobivanju biološkog materijala iz sinteze. Ali postoje i drugi načini.
Trenutno postoji pet glavnih sustava izražavanja:
- Sistem ekspresije E. coli.
- Sustav ekspresije kvasca.
- Sustav ekspresije stanica insekata.
- Sistem ekspresije stanica sisavaca.
- Sustav ekspresije proteina bez stanica.
Potonja opcija je posebno prikladna za ekspresiju transmembranskih proteinai toksičnih spojeva. Posljednjih godina tvari koje je teško eksprimirati konvencionalnim intracelularnim metodama uspješno su integrirane u stanice in vitro. U Bjelorusiji se široko koristi proizvodnja rekombinantnih proteina. Brojna su poduzeća u državnom vlasništvu koja se bave ovim pitanjem.
Cell Free Protein Synthesis System je brza i učinkovita metoda za sintezu ciljnih tvari dodavanjem različitih supstrata i energetskih spojeva potrebnih za transkripciju i translaciju u enzimskom sustavu staničnih ekstrakata. Posljednjih godina postupno su se pojavile prednosti metoda bez stanica za vrste tvari kao što su složene, toksične membrane, pokazujući njihovu potencijalnu primjenu u biofarmaceutskom polju.
Tehnologija bez stanica može jednostavno i kontrolirano dodati razne neprirodne aminokiseline kako bi se postigla složena modifikacija koja je teško razriješiti nakon konvencionalne rekombinantne ekspresije. Takve metode imaju veliku primjenu i potencijal za isporuku lijekova i razvoj cjepiva pomoću čestica sličnih virusu. Veliki broj membranskih proteina uspješno je eksprimiran u slobodnim stanicama.
Izraz kompozicija
Rekombinantni protein CFP10-ESAT 6 se proizvodi i koristi za stvaranje cjepiva. Takav alergen tuberkuloze omogućuje vam jačanje imunološkog sustava i razvoj antitijela. Općenito, molekularne studije uključuju proučavanje bilo kojeg aspekta proteina, kao što su struktura, funkcija, modifikacije, lokalizacija ili interakcije. Istražitikako određene tvari reguliraju unutarnje procese, istraživači obično zahtijevaju sredstva za proizvodnju funkcionalnih spojeva od interesa i koristi.
S obzirom na veličinu i složenost proteina, kemijska sinteza nije održiva opcija za ovaj poduhvat. Umjesto toga, žive stanice i njihovi stanični strojevi obično se koriste kao tvornice za stvaranje i konstruiranje tvari na temelju dobivenih genetskih predložaka. Sustav ekspresije rekombinantnog proteina tada stvara potrebnu strukturu za stvaranje lijeka. Slijedi odabir potrebnog materijala za različite kategorije lijekova.
Za razliku od proteina, DNK je lako konstruirati sintetički ili in vitro koristeći dobro uhodane rekombinantne tehnike. Stoga se DNK šabloni specifičnih gena, sa ili bez dodanih reporterskih sekvenci ili sekvenci afinitetnih oznaka, mogu dizajnirati kao šabloni za ekspresiju praćene tvari. Takvi spojevi izvedeni iz takvih DNK šablona nazivaju se rekombinantni proteini.
Tradicionalne strategije za ekspresiju tvari uključuju transfekciju stanica s DNA vektorom koji sadrži predložak, a zatim kultiviranje stanica za transkribiranje i translaciju željenog proteina. Tipično, stanice se zatim liziraju kako bi se ekstrahirao eksprimirani spoj za naknadno pročišćavanje. Rekombinantni protein CFP10-ESAT6 se obrađuje na ovaj način i prolazi kroz sustav pročišćavanja od mogućihstvaranje toksina. Tek nakon toga ide na sintetizaciju u cjepivo.
Naširoko se koriste i prokariotski i eukariotski in vivo ekspresijski sustavi za molekularne tvari. Izbor sustava ovisi o vrsti proteina, zahtjevima za funkcionalnom aktivnošću i željenom prinosu. Ovi ekspresijski sustavi uključuju sisavce, insekte, kvasce, bakterije, alge i stanice. Svaki sustav ima svoje prednosti i izazove, a odabir pravog sustava za određenu primjenu važan je za uspješno izražavanje tvari koja se revidira.
Izraz od sisavaca
Upotreba rekombinantnih proteina omogućuje razvoj cjepiva i lijekova različitih razina. Za to se može koristiti ova metoda dobivanja tvari. Ekspresijski sustavi sisavaca mogu se koristiti za proizvodnju proteina iz životinjskog carstva koji imaju najnativniju strukturu i aktivnost zbog svog fiziološki relevantnog okruženja. To rezultira visokom razinom posttranslacijske obrade i funkcionalne aktivnosti. Ekspresijski sustavi sisavaca mogu se koristiti za proizvodnju antitijela, složenih proteina i spojeva za upotrebu u funkcionalnim testovima baziranim na stanicama. Međutim, te su prednosti povezane sa strožim uvjetima kulture.
Sustavi ekspresije sisavaca mogu se koristiti za generiranje proteina prolazno ili kroz stabilne stanične linije gdje je ekspresijski konstrukt integriran u genom domaćina. Iako se takvi sustavi mogu koristiti u više eksperimenata, vrijemeproizvodnja može stvoriti veliku količinu tvari u jednom do dva tjedna. Ova vrsta rekombinantne biotehnologije proteina je vrlo tražena.
Ovi prolazni, visokoproduktivni ekspresijski sustavi sisavaca koriste suspenzijske kulture i mogu dati gram po litri. Osim toga, ovi proteini imaju više nativnih preklopnih i posttranslacijskih modifikacija kao što je glikozilacija u usporedbi s drugim sustavima ekspresije.
Izraz insekata
Metode za proizvodnju rekombinantnog proteina nisu ograničene na sisavce. Postoje i produktivniji načini u smislu troškova proizvodnje, iako je prinos tvari po 1 litri tretirane tekućine znatno manji.
Stanice insekata mogu se koristiti za ekspresiju proteina visoke razine s modifikacijama sličnim sustavima sisavaca. Postoji nekoliko sustava koji se mogu koristiti za stvaranje rekombinantnog bakulovirusa, koji se zatim može koristiti za ekstrakciju tvari od interesa u stanicama insekata.
Izrazi rekombinantnih proteina mogu se lako povećati i prilagoditi kulturi suspenzije visoke gustoće za spajanje molekula velikih razmjera. Funkcionalno su sličniji izvornom sastavu tvari sisavaca. Iako prinos može biti do 500 mg/L, proizvodnja rekombinantnog bakulovirusa može biti dugotrajna, a uvjeti uzgoja su teži od prokariotskih sustava. Međutim, u južnijim i toplijim zemljama sličnometoda se smatra učinkovitijom.
Bakterijski izraz
Proizvodnja rekombinantnih proteina može se uspostaviti uz pomoć bakterija. Ova se tehnologija mnogo razlikuje od gore opisanih. Sustavi ekspresije bakterijskih proteina su popularni jer se bakterije lako uzgajaju, brzo rastu i daju visoke prinose rekombinantne formulacije. Međutim, eukariotske tvari s više domena izražene u bakterijama često su nefunkcionalne jer stanice nisu opremljene za izvođenje potrebnih post-translacijskih modifikacija ili molekularnog presavijanja.
Osim toga, mnogi proteini postaju netopivi kao inkluzijske molekule, koje je vrlo teško oporaviti bez oštrih denaturatora i naknadnih glomaznih molekularnih postupaka ponovnog savijanja. Ova se metoda uglavnom smatra još uvijek eksperimentalnom.
Izraz bez ćelije
Rekombinantni protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu stafilokinaze dobiva se na malo drugačiji način. Uključen je u mnoge vrste injekcija, koje zahtijevaju nekoliko sustava prije upotrebe.
Bezstanična ekspresija proteina je in vitro sinteza tvari korištenjem translacijsko kompatibilnih ekstrakata cijelih stanica. U principu, ekstrakti cijelih stanica sadrže sve makromolekule i komponente potrebne za transkripciju, prijevod, pa čak i posttranslacijsku modifikaciju.
Ove komponente uključuju RNA polimerazu, regulatorne proteinske faktore, oblike transkripcije, ribosome i tRNA. Prilikom dodavanjakofaktori, nukleotidi i specifični genski predložak, ovi ekstrakti mogu sintetizirati proteine od interesa u nekoliko sati.
Iako nisu održivi za proizvodnju velikih razmjera, sustavi ekspresije proteina bez stanica ili in vitro (IVT) nude niz prednosti u odnosu na konvencionalne in vivo sustave.
Ekspresija bez stanica omogućuje brzu sintezu rekombinantnih formulacija bez uključivanja stanične kulture. Sustavi bez stanica omogućuju označavanje proteina modificiranim aminokiselinama, kao i ekspresiju spojeva koji prolaze kroz brzu proteolitičku razgradnju unutarstaničnim proteazama. Osim toga, lakše je istovremeno izraziti mnogo različitih proteina metodom bez stanica (na primjer, testiranje mutacija proteina malom ekspresijom iz mnogih različitih rekombinantnih DNA šablona). U ovom reprezentativnom eksperimentu, IVT sustav je korišten za ekspresiju humanog proteina kaspaze-3.
Zaključci i budući izgledi
Proizvodnja rekombinantnih proteina sada se može promatrati kao zrela disciplina. To je rezultat brojnih inkrementalnih poboljšanja u pročišćavanju i analizi. Trenutno se programi otkrivanja lijekova rijetko zaustavljaju zbog nemogućnosti proizvodnje ciljanog proteina. Paralelni procesi za ekspresiju, pročišćavanje i analizu nekoliko rekombinantnih supstanci danas su dobro poznati u mnogim laboratorijima diljem svijeta.
Proteinski kompleksi i rastući uspjeh u izradisolubilizirane membranske strukture zahtijevat će više promjena kako bi pratile potražnju. Pojava učinkovitih ugovornih istraživačkih organizacija za redovitiju opskrbu proteinima omogućit će preraspodjelu znanstvenih resursa kako bi se odgovorilo na ove nove izazove.
Osim toga, paralelni tijek rada trebao bi omogućiti stvaranje potpunih biblioteka nadzirane tvari kako bi se omogućila nova identifikacija cilja i napredni probir, zajedno s tradicionalnim projektima otkrivanja malih molekula lijekova.
