U diferencijalnom određivanju enterobakterija i nekih vibrija, Voges-Proskauerova reakcija zauzima posebno mjesto. Test se temelji na sposobnosti bakterija da fermentiraju glukozu u acetoin.
Suština istraživačkog procesa
U mikrobiologiji se Voges-Proskauerova reakcija često koristi za razlikovanje unutar Yersinia obitelji enterobakterija (uključujući patogene pseudotuberkuloze i enterokolitisa), Escherichia coli i aeroba koji stvaraju spore. Rezultat se vizualizira bojanjem medija kada se dodaju određeni reagensi.
Ovaj test pripada IMViC seriji (kratica od Indol, Methyl Red, Voges-Proskauer i Citrate) - skupini identifikacijskih testova uključujući diferencijalne definicije:
- s indolom, na temelju razgradnje triptofana u indol, korišten u prisutnosti Kovacsovog ili Ehrlichovog reagensa;
- korištenjemetilrot, ili metil crveno, koji detektira dati pH kao rezultat metabolizma glukoze;
- Voges-Proskauerove reakcije za detekciju acetil-metilkarbinola;
- iskorištenje citrata uz promjenu boje kao rezultat alkalizacije medija.
Suština procesa je vizualizacija prisutnosti dijagnosticiranih bakterija zbog interakcije acetoina nastalog od njih s kaustičnom potašom u prisutnosti kisika. Acetil-metilkarbinol se oksidira u diacetil, koji tvori svijetlocrveni ili ružičasti spoj. Povećajte osjetljivost testa uvođenjem alfa-naftola prije dodavanja kaustične potaše.
Probna postavka
Formulacija Voges-Proskauerove reakcije uključuje preliminarnu kultivaciju mikroorganizama. Na Clarkovu diferencijalno dijagnostičku podlogu sije se čista kultura, čija je varijacija Clarkov bujon (bez dodatka agar-agara). Koristi se ili gotov medij ili se priprema samostalno. Sastojci uključuju:
- 5g peptona;
- 5g glukoze;
- 5g dvobaznog kalijevog fosfata;
- 1L destilata.
Tijekom studije, kultura se inokulira sterilnom bakteriološkom petljom u tekući medij. Količina - 5 ml u epruveti plus kontrola. Inkubacija se provodi na temperaturi od 35-37 stupnjeva dva dana. Zatim se provodi studija Voges-Proskauerove reakcije u fazama:
- 2, 5 ml bujonske kulture se prenosi u sterilnu epruvetu.
- Dodajte šest kapi alfa-naftola (5% otopine alkohola).
- Dodaj 40%otopina kaustičnog kalija u količini od 0,1 ml, odnosno dvije kapi.
- Mješanje se vrši laganim protresanjem epruvete.
- Procijenite rezultat nakon 15 minuta od početka eksperimenta.
Alternativna metoda ispitivanja je inkubacija preko noći, čije se vrijeme smanjuje na 18 sati ili do jedan dan. Uz ovu metodu koristi se i ekspresni test: kultura se u petlju unese u 2 ml medija, inkubira oko četiri sata, zatim se dodaju reagensi u jednakoj količini od 2-3 kapi, pomiješaju i rezultat se procjenjuje nakon deset minuta.
Kontrola je jedan od uzročnika pneumonije Klebsiella pneumoniae - soj atcc 13883.
Procjena rezultata
Nakon potrebnog vremena nakon dodavanja reagensa (od 5 do 15 minuta), treba uočiti trešnja-crvenu boju s izraženom pozitivnom reakcijom, crvenu i ružičastu - sa slabom pozitivnom reakcijom. Nijedna promjena nije zabilježena kao negativan rezultat.
Višak kaustične potaše u otopini može dati imitaciju pozitivne reakcije, bojenje u bakrenu boju. U tom slučaju treba zabilježiti negativan odgovor testirane kolonije. Također, bojenje bakra se pojavljuje u slučajevima kada se procjena daje sat vremena nakon uvođenja reagensa.
Prilikom ocjenjivanja rezultata mora se uzeti u obzir da dugotrajno uzgajanje ispitivanih mikroorganizama (više od tri dana) dovodi do zakiseljavanja medija, što može dovesti do pogrešnog ishoda istraživanja. Reakcija može biti blago pozitivna ililažno negativan.
Zahtjevi za test reagense
Voges-Proskauer reagensi moraju ispunjavati zahtjeve kao što su ispravna koncentracija, visoka čistoća i stabilnost, što se postiže pravilnim skladištenjem.
Ketovi za testiranje spremni za korištenje obično sadrže reagense za 100 ili više namjena i dolaze u plastičnim ili obojenim staklenim bočicama. Kvaliteta je regulirana relevantnom dokumentacijom.
