Pri proučavanju tvari u organskoj kemiji koristi se više od desetak različitih kvalitativnih reakcija za određivanje sadržaja određenih spojeva. Takva vizualna analiza omogućuje vam da odmah shvatite jesu li prisutne potrebne tvari, a ako nisu prisutne, možete značajno smanjiti daljnje eksperimente kako biste ih identificirali. Ove reakcije uključuju ninhidrin, koji je glavni u vizualnom određivanju amino spojeva.
Što je ovo?
Ninhidrin je dikarbonilni spoj koji sadrži jedan aromatski prsten s heterociklom vezan za njega, čiji drugi atom ima 2 hidroksilne skupine (OH-). Ova tvar se dobiva izravnom oksidacijom inandiona - 1, 3, te stoga, prema međunarodnoj nomenklaturi, ima sljedeći naziv: 2, 2 - dihidroksiinandion -1, 3 (slika 1).
Čisti ninhidrin je žuti ili bijeli kristalboje koje se zagrijavanjem dobro otapaju u vodi i drugim polarnim organskim otapalima, kao što je aceton. Ovo je prilično štetna tvar, ako dođe u dodir s kožom u velikim količinama ili sluznicom, uzrokuje iritaciju, uključujući i kada se udiše. Rad s ovim spojem treba biti oprezan i samo u rukavicama, jer kada dođe u dodir s kožom, on reagira s proteinima stanica kože i oboji je u ljubičastu boju.
Reaktivne tvari
Kao što je gore spomenuto, reakcija ninhidrina se prvenstveno koristi za vizualno određivanje sadržaja amino spojeva:
- α-aminokiseline (uključujući proteine);
- amino šećeri;
- alkaloidi koji sadrže –NH2 i -NH grupe;
- razni amini.
Treba napomenuti da sekundarni i tercijarni amini ponekad reagiraju vrlo slabo, pa je potrebno više istraživanja kako bi se potvrdila njihova prisutnost.
Različite metode kromatografije koriste se za kvantitativno određivanje, na primjer, papirna kromatografija (BC), tankoslojna kromatografija (TLC) ili ispiranje čvrstih nosača otopinom ninhidrina u različitim medijima.
Ova reakcija nije specifična za amino spojeve, budući da reagens može ući u nju odjednom. Međutim, na dijelu produkta reakcije ima posebnost u vidu oslobađanja mjehurića ugljičnog dioksida (CO2), a to je tipično samo pri interakciji s α-amino kiseline.
Značajke mehanizma
BU literaturi postoje različite interpretacije jednadžbe reakcije ninhidrina. Neki istraživači izostavljaju stvaranje hidrindantina iz 2-aminoinndiona, koji uz sudjelovanje amonijaka i ninhidrina također tvori tvar za bojenje pod nazivom "Ruemanova ljubičasta" (ili "Ruemanova plava"), dok drugi, naprotiv, pretpostavljaju samo njegovu sudjelovanje bez prisutnosti intermedijarnih amino proizvoda. Postoje i neke zanimljive točke u zapisu o samoj reakciji, posebice, to se tiče metoda vezivanja amino derivata ninhidrina na njegovu glavnu molekulu kako bi se stvorila boja. Naznaka mjesta "hodajućeg vodika" dobivenog intermedijarnim aminom iz vodenog medija također ostaje upitna: može biti ili u ketonskoj skupini ili pored –NH2.
U stvarnosti, nijansa s atomom H je beznačajna, budući da njegov položaj u spoju ne igra posebnu ulogu u tijeku reakcije, pa na to ne treba obraćati pažnju. Što se tiče izostavljanja jednog od mogućih stadija, ovdje razlog leži u teorijskom aspektu: do sada nije precizno utvrđen točan mehanizam nastanka Ruemanovog ljubičastog, pa se mogu pronaći sasvim različite sheme reakcije ninhidrina.
Najcjelovitiji mogući tijek interakcije reagensa s amino spojevima bit će predložen u nastavku.
Mehanizam reakcije
Prvo, ninhidrin stupa u interakciju s α-amino kiselinom, vežući je na mjesto cijepanja hidroksi skupina i tvoreći proizvod kondenzacije (slika 2a). Zatim se potonji uništava, oslobađajući intermedijarni amin, aldehid i ugljični dioksid (slika 2b). Od konačnog proizvoda prilikom spajanjaninhidrina, sintetizira se Rueman purpurna struktura (diketonhidrindenketohidrinamin, slika 2c). Također je naznačeno moguće stvaranje hidrindatina (reducirani ninhidrin) iz intermedijarnog amina, koji se također pretvara u spoj za bojenje u prisutnosti amonijaka (točnije, amonijevog hidroksida) s viškom samog reagensa (slika 2d).
Nastanak hidrindatina dokazao je sam Rueman kada sumporovodik djeluje na molekulu ninhidrina. Ovaj spoj se može otopiti u natrijevom karbonatu Na2CO3, obojivši otopinu tamno crvenom bojom. A kada se doda razrijeđena klorovodična kiselina, taloži se hidrindantin.
Najvjerojatnije su međuamin, hidridantin, ninhidrin i struktura boje, zbog svoje nestabilnosti pri zagrijavanju, u nekoj ravnoteži, što omogućuje prisutnost nekoliko dodatnih faza.
Ovaj mehanizam je prikladan za objašnjenje reakcije ninhidrina s drugim amino spojevima, s izuzetkom nusproizvoda koji nastaju eliminacijom ostatka strukture iz –NH2, -NH ili -N.
Biuret test i druge reakcije na proteine
Kvalitativna analiza peptidnih veza čak i neproteinskih struktura može se odvijati ne samo uz sudjelovanje gornjeg reagensa. Međutim, u slučaju reakcije ninhidrina na proteine, interakcija se ne odvija duž –CO-NH‒ skupina, već duž aminskih skupina. Postoji takozvana "biuretna reakcija", koju karakterizira dodavanje iona u otopinu s amino spojevimadvovalentni bakar iz CuSO4 ili Cu(OH)2 u alkalnom mediju (slika 3).
Tijekom analize, u prisutnosti potrebnih struktura, otopina postaje tamnoplava zbog vezanja peptidnih veza u kompleks boje, koji razlikuje jedan reagens od drugog. Zato su reakcije biureta i ninhidrina univerzalne u odnosu na proteinske i neproteinske strukture sa –CO-NH‒ grupom.
Prilikom određivanja cikličkih aminokiselina koristi se ksantoproteinska reakcija s koncentriranom otopinom dušične kiseline HNO3 , koja pri nitriranju daje žutu boju. Kap reagensa na koži također pokazuje žutu boju reakcijom s aminokiselinama u stanicama kože. Dušična kiselina može uzrokovati opekline i treba je također rukovati u rukavicama.
Primjeri interakcije s amino spojevima
Ninhidrinska reakcija za α-aminokiseline daje dobar vizualni rezultat, osim struktura prolina u boji i hidroksiprolina koje reagiraju stvaranjem žute boje. Moguće objašnjenje za ovaj učinak pronađeno je u drugim okolišnim uvjetima interakcije ninhidrina s tim strukturama.
Reakcija s amino grupom
Budući da test nije specifičan, vizualna detekcija alanina pomoću reakcije ninhidrina u smjesi nije moguća. Međutim, papirnom kromatografijom, kada se nanose uzorci različitih α-aminokiselina, prskaju ih vodenom otopinom ninhidrina i razvijaju u posebnom mediju, može seizračunati kvantitativni sastav ne samo spoja za koji se tvrdi da je to spoj, već i mnogih drugih.
Shematski, interakcija alanina s ninhidrinom slijedi isti princip. Veže se na reagens na aminskoj skupini, te se pod djelovanjem aktivnih hidronijevih iona (H3O+) odcijepi na ugljiku -dušikova veza, koja se razlaže na acetaldehid (CH3COH) i ugljični dioksid (CO2). Druga molekula ninhidrina veže se na dušik, istiskujući molekule vode i formira se struktura boje (slika 4).
Reakcija s heterocikličkim amino spojem
Reakcija ninhidrina s prolinom je specifična, posebno u kromatografskim analizama, budući da takve strukture u kiselom mediju prvo požute, a zatim postanu ljubičaste u neutralnom. Istraživači to objašnjavaju značajkom preuređivanja ciklusa u međuspoju, na koji utječe upravo prisutnost velikog broja vodikovih protona koji nadopunjuju vanjsku energetsku razinu dušika.
Ne dolazi do uništenja heterocikla, a na 4. atom ugljika na njega je vezana još jedna molekula ninhidrina. Nakon daljnjeg zagrijavanja, nastala struktura u neutralnom mediju postaje Rueman ljubičasta (slika 5).
Priprema glavnog reagensa
Ninhidrinski test se provodi s različitim otopinama, ovisno o otapanju amino struktura u određenim organskim ianorganski spojevi.
Glavni reagens je priprema 0,2% otopine u vodi. Ovo je svestrana mješavina, budući da se većina spojeva dobro otapa u H2O. Za dobivanje svježe pripremljenog reagensa, uzorak od 0,2 g kemijski čistog ninhidrina razrijedi se u 100 ml vode.
Vrijedi napomenuti da je za neke analizirane otopine ova koncentracija nedovoljna, pa se mogu pripremiti 1% ili 2% otopine. To je tipično za ekstrakte iz ljekovitih sirovina, budući da sadrže različite klase amino spojeva.
Kada se provode kromatografske studije, otopine, na primjer, pri ispiranju smjese na čvrstom nosaču kroz kolonu, mogu se pripremiti u alkoholu, dimetil sulfoksidu, acetonu i drugim polarnim otapalima - sve će ovisiti o otapalu određenih amino strukture.
Prijava
Reakcija ninhidrina omogućuje otkrivanje mnogih amino spojeva u otopini, što ga čini jednim od prvih koji se koristi u kvalitativnoj analizi organskih tvari. Vizualno određivanje značajno smanjuje broj eksperimenata, posebno kada se analiziraju slabo proučavane biljke, lijekovi i oblici doziranja, kao i nepoznate otopine i smjese.
U forenzičkoj znanosti, ova metoda se široko koristi za određivanje prisutnosti tragova znoja na bilo kojoj površini.
Čak i usprkos nespecifičnosti reakcije, povlačenje reakcije ninhidrina iz kemijske prakse je nemoguće, jerzamjenom ove tvari manje toksičnim analozima (npr. oksolinom) dokazano je da imaju lošiju osjetljivost na amino skupine i ne daju dobre rezultate u fotometrijskim analizama.
