Apsorpcija i daljnja ponovna emisija svjetlosti od strane anorganskih i organskih medija rezultat je fosforescencije ili fluorescencije. Razlika između fenomena je duljina intervala između apsorpcije svjetlosti i emisije struje. Kod fluorescencije ti se procesi odvijaju gotovo istovremeno, a kod fosforescencije s određenim zakašnjenjem.
Povijesna pozadina
Godine 1852. britanski znanstvenik Stokes prvi je opisao fluorescenciju. Novi termin je skovao kao rezultat svojih eksperimenata s fluorom, koji je emitirao crvenu svjetlost kada je bio izložen ultraljubičastom svjetlu. Stokes je primijetio zanimljiv fenomen. Otkrio je da je valna duljina fluorescentnog svjetla uvijek duža od valne duljine ekscitacijske svjetlosti.
U 19. stoljeću provedeni su mnogi eksperimenti kako bi se potvrdila hipoteza. Pokazali su da različiti uzorci fluoresciraju kada su izloženi ultraljubičastom svjetlu. Materijali su između ostalog uključivali kristale, smole, minerale, klorofil,ljekovite sirovine, anorganski spojevi, vitamini, ulja. Izravna upotreba boja za biološku analizu započela je tek 1930.
Opis fluorescentne mikroskopije
Neki od materijala korištenih u istraživanju u prvoj polovici 20. stoljeća bili su vrlo specifični. Zahvaljujući pokazateljima koji se ne mogu postići kontrastnim metodama, metoda fluorescentne mikroskopije postala je važan alat u biomedicinskim i biološkim istraživanjima. Dobiveni rezultati bili su od ne male važnosti za znanost o materijalima.
Koje su prednosti fluorescentne mikroskopije? Uz pomoć novih materijala postalo je moguće izolirati visoko specifične stanice i submikroskopske komponente. Fluorescentni mikroskop omogućuje otkrivanje pojedinačnih molekula. Razne boje omogućuju identificiranje nekoliko elemenata u isto vrijeme. Iako je prostorna razlučivost opreme ograničena granicom difrakcije, koja pak ovisi o specifičnim svojstvima uzorka, detekcija molekula ispod ove razine također je sasvim moguća. Različiti uzorci pokazuju autofluorescenciju nakon zračenja. Ovaj se fenomen naširoko koristi u petrologiji, botanici, industriji poluvodiča.
Značajke
Proučavanje životinjskih tkiva ili patogenih mikroorganizama često je komplicirano ili preslabom ili vrlo jakom nespecifičnom autofluorescencijom. Međutim, vrijednost uistraživanje stječe uvođenje u materijal komponenti koje su pobuđene na određenoj valnoj duljini i emitiraju svjetlosni tok potrebnog intenziteta. Fluorokromi djeluju kao boje sposobne za samopričvršćivanje na strukture (nevidljive ili vidljive). Istodobno, odlikuje ih visoka selektivnost u odnosu na ciljeve i kvantni prinos.
Fluorescentna mikroskopija postala je široko korištena s pojavom prirodnih i sintetičkih boja. Imali su specifične profile intenziteta emisije i ekscitacije i bili su usmjereni na specifične biološke ciljeve.
Identifikacija pojedinačnih molekula
Često, pod idealnim uvjetima, možete registrirati sjaj jednog elementa. Za to je, između ostalog, potrebno osigurati dovoljno nisku buku detektora i optičku pozadinu. Molekula fluoresceina može emitirati do 300.000 fotona prije uništenja zbog fotoizbjeljivanja. Uz stopu naplate od 20% i učinkovitost procesa, mogu se registrirati u iznosu od oko 60 tisuća
Fluorescentna mikroskopija, zasnovana na lavinskim fotodiodama ili umnožavanju elektrona, omogućila je istraživačima da promatraju ponašanje pojedinačnih molekula na sekunde, au nekim slučajevima i na minute.
Poteškoće
Ključni problem je suzbijanje buke iz optičke pozadine. Zbog činjenice da mnogi materijali korišteni u konstrukciji filtara i leća pokazuju određenu autofluorescenciju, napori znanstvenika u početnim su fazama bili usmjereni na izdavanjekomponente s niskom fluorescencijom. Međutim, kasniji eksperimenti doveli su do novih zaključaka. Konkretno, utvrđeno je da fluorescentna mikroskopija temeljena na ukupnoj unutarnjoj refleksiji postiže nisku pozadinu i visoku ekscitacijsko svjetlo.
Mehanizam
Načela fluorescentne mikroskopije temeljena na totalnoj unutarnjoj refleksiji su korištenje vala koji se brzo raspada ili se ne širi. Nastaje na sučelju između medija s različitim indeksima loma. U tom slučaju svjetlosni snop prolazi kroz prizmu. Ima visok indeks loma.
Prizma je u blizini vodene otopine ili stakla niskog parametra. Ako je snop svjetlosti usmjeren na njega pod kutom koji je veći od kritičnog, snop se potpuno odbija od sučelja. Ovaj fenomen, zauzvrat, dovodi do vala koji se ne širi. Drugim riječima, generira se elektromagnetno polje koje prodire u medij s nižim indeksom loma na udaljenosti manjoj od 200 nanometara.
U valu koji se ne širi, intenzitet svjetlosti će biti sasvim dovoljan da pobuđuje fluorofore. Međutim, zbog iznimno male dubine, njegov će volumen biti vrlo mali. Rezultat je pozadina niske razine.
Izmjena
Fluorescentna mikroskopija bazirana na totalnoj unutarnjoj refleksiji može se realizirati epi-osvjetljenjem. Za to su potrebne leće s povećanim numeričkim otvorom blende (najmanje 1,4, ali je poželjno da dosegne 1,45-1,6), kao i djelomično osvijetljeno polje aparata. Potonje se postiže malim mjestom. Za veću ujednačenost koristi se tanki prsten kroz koji se blokira dio protoka. Da bi se dobio kritični kut nakon kojeg dolazi do potpunog odsjaja, potrebna je visoka razina loma imerzijskog medija u lećama i pokrovnom staklu mikroskopa.
