Što je u osnovi DNK hibridizacije? Iako je dvolančani slijed DNA općenito stabilan u fiziološkim uvjetima, promjena tih uvjeta u laboratoriju (obično povećanjem temperature okoline) dovest će do razdvajanja molekula u pojedinačne niti. Potonji su međusobno komplementarni, ali također mogu nadopunjavati druge sekvence prisutne u njihovom okruženju. Snižavanje temperature okoline omogućuje jednolančanim molekulama da se žare ili "hibridiziraju" jedna s drugom. Ovo je metoda hibridizacije DNK.
Koncept s gledišta molekularne biologije
Znanstvenici uključeni u replikaciju DNK i transkripciju DNK u RNA oslanjaju se na nukleotidne križanja i tehnike molekularne biologije. To uključuje Southern i Northern mrlje, lančanu reakciju polimeraze (PCR) i većinu DNA-RNA hibridizacije i pristupa sekvenciranju.
Prijava
Hibridizacija je glavno svojstvo nukleotidasekvence i koristi se u brojnim metodama molekularne biologije. Ukupni genetski odnos dviju vrsta može se odrediti hibridizacijom segmenata njihove DNK (DNA-DNA hibridizacija). Zbog sličnosti sekvenci između blisko povezanih organizama, potrebna je viša temperatura za taljenje takvih DNK hibrida u usporedbi s udaljenijim organizmima. Različite metode koriste hibridizaciju za određivanje porijekla uzorka DNA, uključujući lančanu reakciju polimeraze (PCR). U drugoj metodi, kratke DNA sekvence su hibridizirane u staničnu mRNA kako bi se identificirali eksprimirani geni. Farmaceutske tvrtke istražuju upotrebu antisense RNA za vezanje na neželjenu mRNA, sprječavajući ribosom da prevede mRNA u protein.
DNA-DNA hibridizacija općenito se odnosi na tehniku molekularne biologije koja mjeri stupanj genetske sličnosti između skupova DNA sekvenci. Obično se koristi za određivanje genetske udaljenosti između dva organizma. Široko se koristio u filogeniji i taksonomiji.
Metodologija
DNA iz jednog organizma je obilježena, a zatim pomiješana s neobilježenom DNK koja se mogla usporediti s njim. Smjesa se inkubira kako bi se DNA lančići disocirali, a zatim ohladila kako bi se formirala regenerirana hibridna dvolančana DNA. Hibridizirane sekvence s visokim stupnjem sličnosti vezat će se čvršće i zahtijevati više energije za njihovo razdvajanje: tj. odvajaju se kada se zagrijavaju na višojtemperatura od različitih sekvenci, proces poznat kao "tapanje DNK".
otopljenje DNK
Procjenjujući profil taljenja hibridizirane DNK, dvolančana DNK se veže na takozvani "stupac" i rezultirajuća smjesa se zagrijava. U svakom koraku, kolona se ispere i DNA sekvence koje se otape postaju jednolančane i ispiru se kolonu. Temperature na kojima obilježena DNK izlazi iz stupca odražava količinu sličnosti između sekvenci (a uzorak samosavijanja služi kao kontrola). Ovi rezultati se kombiniraju kako bi se odredio stupanj genetske sličnosti između organizama. Prema modernoj mikrobiologiji, hibridizacija DNK je nemoguća bez razumijevanja ovih stvari.
Kada se više vrsta ribonukleinske kiseline (ili deoksiribonukleinske) kiseline usporedi na ovaj način, vrijednosti sličnosti omogućuju da se vrsta smjesti u filogenetsko stablo. Stoga je ovo jedan od mogućih pristupa provođenju molekularne sistematike. Charles Sibley i John Ahlquist, pioniri ove tehnike, koristili su DNK-DNA hibridizaciju za proučavanje filogenetskih odnosa ptica (taksonomija Sibley-Ahlquista) i primata.
Važnost za biologiju
DNA-DNA hibridizacija je zlatni standard za razlikovanje bakterijskih vrsta, s vrijednošću sličnosti većom od 70%, što ukazuje da uspoređeni sojevi pripadaju različitim vrstama. Godine 2014. predložen je prag od 79% sličnosti za odvajanje bakterijske podvrste.
Kritičari tvrde da je tehnika netočna za uspoređivanje blisko povezanih vrsta, budući da je svaki pokušaj mjerenja razlika između ortolognih sekvenci između organizama preopterećen hibridizacijom paralognih parnjaka u genomu organizma. Sekvenciranje DNK i usporedbe računalnih sekvenci trenutno su uobičajena metoda za određivanje genetske udaljenosti, iako se ovaj pristup još uvijek koristi u mikrobiologiji za pomoć pri identifikaciji bakterija.
Trenutni način je provođenje DNK-DNA hibridizacije u silikonu korištenjem potpuno ili djelomično sekvenciranih genoma. GGDC koji je razvio DSMZ najtočniji je poznati alat za izračun vrijednosti sličnih DDH. Između ostalih algoritamskih poboljšanja, rješava problem s paralognim sekvencama tako što ih pažljivo filtrira iz podudaranja između dva slijeda genoma.
FISH metoda
Fluorescentna in situ hibridizacija (FISH) je laboratorijska tehnika koja se koristi za otkrivanje i sekvenciranje DNK, često na određenom kromosomu.
Godine 1969., Joseph Gall i Mary Lou Pardu objavili su rad koji je pokazao da se radioaktivne kopije ribosomske sekvence DNA mogu koristiti za otkrivanje komplementarnih sekvenci DNA u jezgri žabljeg jajeta. Od ovih izvornih zapažanja, mnoga su poboljšanja povećala svestranost iosjetljivost postupka do te mjere da se in situ hibridizacija ("na mjestu", latinski) danas smatra važnim alatom u citogenetici. (Izraz in situ sada se također koristi za označavanje početne faze rasta karcinoma, kada je samo epitelno tkivo uključeno u patološki proces.)
Slijed fluorescentne hibridizacije
RNA sonde mogu biti dizajnirane za bilo koji gen ili bilo koju sekvencu unutar gena za vizualizaciju lncRNA i miRNA mRNA u tkivima i stanicama. FISH se koristi proučavanjem ciklusa reprodukcije stanica, posebno nuklearne interfaze za sve kromosomske abnormalnosti. FISH vam omogućuje analizu velikog niza arhivskih slučajeva, puno je lakše identificirati identificirani kromosom stvaranjem sonde s umjetnom bazom kromosoma koja će privući slične kromosome.
Hibridizacijski signali za svaku sondu kada se otkrije nuklearna abnormalnost: svaka mRNA i lncRNA detekciona sonda se sastoji od 20 parova oligonukleotida, svaki par pokriva prostor od 40-50 bp. p. Sonde koriste zaštićenu kemiju za otkrivanje mRNA.
Hibridizacija s DNK sondama
Probe se često izrađuju od fragmenata DNK koji su izolirani, pročišćeni i pojačani za korištenje u dizajnu ljudskog genoma. Veličina ljudskog genoma je toliko velika u usporedbi s duljinom koja se može izravno sekvencirati da ga je potrebno podijeliti naulomci. U konačnici, ovi su fragmenti naručeni probavljanjem kopije svakog fragmenta u još manje jedinice korištenjem endonukleaza specifičnih za sekvencu kako bi se izmjerila veličina svakog malog fragmenta pomoću kromatografije isključivanja veličine koristeći ove informacije kako bi se utvrdilo gdje se veliki fragmenti međusobno preklapaju..
Da bi se sačuvali elementi s njihovim pojedinačnim sekvencama DNK, fragmenti su dodani u sustav bakterijskih populacija koje se stalno ponavljaju. Klonske populacije bakterija, od kojih svaka populacija održava jedan umjetni kromosom, pohranjene su u raznim laboratorijima diljem svijeta. Umjetni kromosomi (BAC) mogu se uzgajati, ekstrahirati i obilježiti u bilo kojem laboratoriju koji sadrži biblioteku. Genomske knjižnice često se nazivaju prema institucijama u kojima su razvijene. Primjer je biblioteka RPCI-11, nazvana po Roswell Cancer Instituteu u Buffalu (New York, SAD). Ovi fragmenti čine oko 100 tisuća parova baza i osnova su većine FISH sondi.
